血清外泌體癌胚抗原檢測作為肝癌和膽管癌診斷指標的臨床應用

苗 輝

河南省鄭州市第三人民醫院檢驗科 450000

原發性肝癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，其主要包括肝細胞癌及肝內膽管細胞癌，該病的發病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，臨床上多采取影像學方法診斷肝癌和膽管癌等疾病，但由于肝癌和膽管癌的影像學表現均為肝內占位，但肝癌和膽管癌的治療方式及預后均不同，因此在選擇治療方法時應對患者疾病類型進行鑒別診斷，以選擇適合的治療方案。由于肝癌和膽管癌起病較隱匿，早期無特異性臨床表現，很難在早期發現疾病，因此需選擇一種有效的診斷方法。

近年來，腫瘤標志物已成為診斷惡性腫瘤的主要方法。血清腫瘤標志物是機體在癌細胞產生及增殖中與癌細胞反應時產生，腫瘤標志物檢測具有無創、靈敏性高及診斷效果好等優勢，早期即可在患者血清中檢測到[2]。相關研究發現，腫瘤標志物血清癌胚抗原與肝癌的診斷具有相關性[3]。但血清CEA水平對腫瘤早期診斷的敏感性稍差。外泌體包含了復雜 RNA 和蛋白質的小膜泡，廣泛存在于機體的血細胞、腫瘤細胞等細胞中的囊泡樣結構，在機體處于生理或病理狀態時大量釋放，由于外泌體中含有受體、蛋白及核酸等，故外泌體能夠向受體細胞傳遞遺傳信息。研究表明，外泌體內的許多蛋白可對腫瘤進行早期診斷[4]。鑒于此，本文探討血清外泌體CEA檢測在肝癌和膽管癌鑒別診斷中的價值，具體如下。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取2018年3月—2019年3月就診于我院的30例膽管癌患者作為膽管癌組，選取30例肝癌患者作為肝癌組，另選取同期30例健康體檢者作為對照組。膽管癌組中男16例，女14例；年齡38～75歲，平均年齡(55.42±5.33)歲。肝癌組中男17例，女13例；年齡39～76歲，平均年齡(55.53±5.45)歲。對照組中男16例，女14例；年齡38～77歲，平均年齡(55.62±5.43)歲。本研究經醫院倫理委員會批準并通過，且患者及其家屬均簽署了知情同意書。兩組患者的基本資料經統計學比較后無顯著差異性(P>0.05)。納入標準：(1)符合第9版《中西醫結合外科學》中疾病診斷者[5]；(2)經CT增強和磁共振檢查證實者；(3)未接受藥物和手術治療者。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)精神異常者；(3)嚴重心律失常者；(4)合并血液及免疫系統疾病者。

1.2 方法 血清外泌體提取：將血清標本進行離心15min，設置轉速為3 000r/min，去除殘留細胞和細胞碎片，吸取250μl上清液到新管中，加入63μl ExoQuick試劑進行充分混勻，靜置于室溫下30min后進行離心30min，設置轉速為1 500r/min，棄去上層清液后再次進行離心5min，設置轉速為1 500r/min，棄上層清液后剩余沉淀為血清外泌體。(1)血清外泌體CEA檢測：采用qRT-PCR法進行檢測，去除殘留細胞，血清樣本使用封閉液選擇PBS 緩沖液，稀釋倍數為500倍，用100ml RIPA裂解液在冰上沉淀裂解30min，并進行振蕩以充分混勻，繼續稀釋。在血清CEA抗體包被微孔板上加入稀釋后的血清及外泌體樣品100μl，于37 ℃條件下孵育1h，甩掉微孔板中的液體后拍干，加入A液，繼續在37 ℃條件下孵育1h，連續洗板3次，加入B液，于37 ℃條件下孵育30min，連續洗板5次后加入90μl底物，于37℃條件下避光孵育15min，加入50μl終止液，在450nm波長下進行測定。(2)血清CEA水平檢測：采集受試者空腹靜脈血5ml，置于真空采血管中，于25℃條件下沉淀30min，使用離心機進行離心10min，設置轉速為4 000r/min，將真空采血管置于-25℃冰箱中進行保存。采用化學發光免疫分析法檢測血清CEA水平。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。陽性判斷標準：CEA>3.4μg/L為陽性[6]。

2 結果

2.1 各組的血清CEA水平比較 肝癌組、膽管癌組的血清CEA水平明顯高于對照組，且肝癌組的血清CEA水平明顯高于膽管癌組，比較有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組的血清CEA水平比較

2.2 各組的血清外泌體CEA水平比較 肝癌組的血清外泌體CEA水平明顯高于膽管癌組和對照組，比較有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組的血清外泌體CEA水平比較(pg/ml)

2.3 血清CEA水平和血清外泌體CEA的診斷效能比較 肝癌組的血清外泌體CEA曲線下面積明顯高于血清CEA，比較有統計學差異(P<0.05)；膽管癌組的血清外泌體CEA曲線下面積明顯高于血清CEA，比較有統計學差異(P<0.05)；肝癌組的血清外泌體CEA、血清CEA曲線下面積均明顯高于膽管癌組，比較有統計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 血清CEA水平和血清外泌體CEA的診斷效能比較

3 討論

肝癌是一種發病率較高的惡性腫瘤，死亡率較高，患病后嚴重影響患者生命健康[7]。以往臨床多采用影像學方法進行診斷，但易出現漏診，影響患者選擇治療方案并延誤患者的最佳治療時機[8]。腫瘤標志物檢測是一種腫瘤早期篩查手段，但目前尚未發現符合肝癌診斷的腫瘤標志物。研究表明，在多數惡性腫瘤患者血清中能夠檢測大量血清CEA[9]。血清CEA是由腫瘤組織產生的一種腫瘤標志物，在多數腫瘤患者血清中含量顯著升高，但血清CEA水平升高也有可能預示患者治療后的復發或轉移，因此對惡性腫瘤的診斷敏感性較低。研究表明，血清外泌體參與腫瘤的發生發展，由于外泌體中所含的蛋白質、核酸等能夠反映來源細胞的特征和狀態，所以血清外泌體可能為腫瘤早期診斷的標志物[10]。研究顯示，不同腫瘤患者血清中外泌體CEA含量不同[11]。因此，為鑒別肝癌與膽管癌，本文檢測患者血清外泌體中CEA水平。本文結果顯示，肝癌組的血清外泌體CEA水平明顯高于對照組(P<0.05)；肝癌組的血清外泌體CEA曲線下面積明顯高于血清CEA，且肝癌組的血清外泌體CEA、血清CEA曲線下面積均明顯高于膽管癌組(P<0.05)。本研究數據與劉萬超等[12]的結論基本一致。結果說明：血清外泌體CEA對肝癌和膽管癌的診斷效能優于血清CEA，且肝癌患者的血清外泌體CEA水平顯著高于膽管癌，可作為鑒別診斷的指標。分析原因可能為：(1)正常人血清外泌體CEA經胃腸道進行代謝，因此血清外泌體CEA水平較低；但腫瘤患者的血清外泌體CEA經血液和淋巴循環，由于功能受阻，進而導致血清外泌體CEA水平明顯升高[13]。(2)在腫瘤發生、發展過程中，腫瘤細胞排列極性消失，患者血清中CEA水平呈陽性[14]。(3)肝癌患者的肝臟功能較差，肝細胞的攝取、代謝能力下降，肝內血液分流致使CEA直接入血，血清CEA增加，且高于肝膽癌。因此血清CEA水平可作為肝癌和膽管癌的診斷指標[15]。

綜上所述，血清外泌體CEA對肝癌和膽管癌的診斷效能優于血清CEA，且肝癌的血清外泌體CEA水平高于膽管癌，血清外泌體CEA可作為肝癌和膽管癌鑒別診斷的有效指標，值得在臨床推廣。