血清外泌體癌胚抗原檢測(cè)作為肝癌和膽管癌診斷指標(biāo)的臨床應(yīng)用

苗 輝

河南省鄭州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 450000

原發(fā)性肝癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，其主要包括肝細(xì)胞癌及肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，該病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，臨床上多采取影像學(xué)方法診斷肝癌和膽管癌等疾病，但由于肝癌和膽管癌的影像學(xué)表現(xiàn)均為肝內(nèi)占位，但肝癌和膽管癌的治療方式及預(yù)后均不同，因此在選擇治療方法時(shí)應(yīng)對(duì)患者疾病類型進(jìn)行鑒別診斷，以選擇適合的治療方案。由于肝癌和膽管癌起病較隱匿，早期無特異性臨床表現(xiàn)，很難在早期發(fā)現(xiàn)疾病，因此需選擇一種有效的診斷方法。

近年來，腫瘤標(biāo)志物已成為診斷惡性腫瘤的主要方法。血清腫瘤標(biāo)志物是機(jī)體在癌細(xì)胞產(chǎn)生及增殖中與癌細(xì)胞反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生，腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有無創(chuàng)、靈敏性高及診斷效果好等優(yōu)勢(shì)，早期即可在患者血清中檢測(cè)到[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物血清癌胚抗原與肝癌的診斷具有相關(guān)性[3]。但血清CEA水平對(duì)腫瘤早期診斷的敏感性稍差。外泌體包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡，廣泛存在于機(jī)體的血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞中的囊泡樣結(jié)構(gòu)，在機(jī)體處于生理或病理狀態(tài)時(shí)大量釋放，由于外泌體中含有受體、蛋白及核酸等，故外泌體能夠向受體細(xì)胞傳遞遺傳信息。研究表明，外泌體內(nèi)的許多蛋白可對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷[4]。鑒于此，本文探討血清外泌體CEA檢測(cè)在肝癌和膽管癌鑒別診斷中的價(jià)值，具體如下。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取2018年3月—2019年3月就診于我院的30例膽管癌患者作為膽管癌組，選取30例肝癌患者作為肝癌組，另選取同期30例健康體檢者作為對(duì)照組。膽管癌組中男16例，女14例；年齡38～75歲，平均年齡(55.42±5.33)歲。肝癌組中男17例，女13例；年齡39～76歲，平均年齡(55.53±5.45)歲。對(duì)照組中男16例，女14例；年齡38～77歲，平均年齡(55.62±5.43)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并通過，且患者及其家屬均簽署了知情同意書。兩組患者的基本資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較后無顯著差異性(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合第9版《中西醫(yī)結(jié)合外科學(xué)》中疾病診斷者[5]；(2)經(jīng)CT增強(qiáng)和磁共振檢查證實(shí)者；(3)未接受藥物和手術(shù)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)精神異常者；(3)嚴(yán)重心律失常者；(4)合并血液及免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法 血清外泌體提取：將血清標(biāo)本進(jìn)行離心15min，設(shè)置轉(zhuǎn)速為3 000r/min，去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片，吸取250μl上清液到新管中，加入63μl ExoQuick試劑進(jìn)行充分混勻，靜置于室溫下30min后進(jìn)行離心30min，設(shè)置轉(zhuǎn)速為1 500r/min，棄去上層清液后再次進(jìn)行離心5min，設(shè)置轉(zhuǎn)速為1 500r/min，棄上層清液后剩余沉淀為血清外泌體。(1)血清外泌體CEA檢測(cè)：采用qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，去除殘留細(xì)胞，血清樣本使用封閉液選擇PBS 緩沖液，稀釋倍數(shù)為500倍，用100ml RIPA裂解液在冰上沉淀裂解30min，并進(jìn)行振蕩以充分混勻，繼續(xù)稀釋。在血清CEA抗體包被微孔板上加入稀釋后的血清及外泌體樣品100μl，于37 ℃條件下孵育1h，甩掉微孔板中的液體后拍干，加入A液，繼續(xù)在37 ℃條件下孵育1h，連續(xù)洗板3次，加入B液，于37 ℃條件下孵育30min，連續(xù)洗板5次后加入90μl底物，于37℃條件下避光孵育15min，加入50μl終止液，在450nm波長下進(jìn)行測(cè)定。(2)血清CEA水平檢測(cè)：采集受試者空腹靜脈血5ml，置于真空采血管中，于25℃條件下沉淀30min，使用離心機(jī)進(jìn)行離心10min，設(shè)置轉(zhuǎn)速為4 000r/min，將真空采血管置于-25℃冰箱中進(jìn)行保存。采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清CEA水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：CEA>3.4μg/L為陽性[6]。

2 結(jié)果

2.1 各組的血清CEA水平比較 肝癌組、膽管癌組的血清CEA水平明顯高于對(duì)照組，且肝癌組的血清CEA水平明顯高于膽管癌組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組的血清CEA水平比較

2.2 各組的血清外泌體CEA水平比較 肝癌組的血清外泌體CEA水平明顯高于膽管癌組和對(duì)照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組的血清外泌體CEA水平比較(pg/ml)

2.3 血清CEA水平和血清外泌體CEA的診斷效能比較 肝癌組的血清外泌體CEA曲線下面積明顯高于血清CEA，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；膽管癌組的血清外泌體CEA曲線下面積明顯高于血清CEA，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；肝癌組的血清外泌體CEA、血清CEA曲線下面積均明顯高于膽管癌組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

表3 血清CEA水平和血清外泌體CEA的診斷效能比較

3 討論

肝癌是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，死亡率較高，患病后嚴(yán)重影響患者生命健康[7]。以往臨床多采用影像學(xué)方法進(jìn)行診斷，但易出現(xiàn)漏診，影響患者選擇治療方案并延誤患者的最佳治療時(shí)機(jī)[8]。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是一種腫瘤早期篩查手段，但目前尚未發(fā)現(xiàn)符合肝癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。研究表明，在多數(shù)惡性腫瘤患者血清中能夠檢測(cè)大量血清CEA[9]。血清CEA是由腫瘤組織產(chǎn)生的一種腫瘤標(biāo)志物，在多數(shù)腫瘤患者血清中含量顯著升高，但血清CEA水平升高也有可能預(yù)示患者治療后的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此對(duì)惡性腫瘤的診斷敏感性較低。研究表明，血清外泌體參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，由于外泌體中所含的蛋白質(zhì)、核酸等能夠反映來源細(xì)胞的特征和狀態(tài)，所以血清外泌體可能為腫瘤早期診斷的標(biāo)志物[10]。研究顯示，不同腫瘤患者血清中外泌體CEA含量不同[11]。因此，為鑒別肝癌與膽管癌，本文檢測(cè)患者血清外泌體中CEA水平。本文結(jié)果顯示，肝癌組的血清外泌體CEA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；肝癌組的血清外泌體CEA曲線下面積明顯高于血清CEA，且肝癌組的血清外泌體CEA、血清CEA曲線下面積均明顯高于膽管癌組(P<0.05)。本研究數(shù)據(jù)與劉萬超等[12]的結(jié)論基本一致。結(jié)果說明：血清外泌體CEA對(duì)肝癌和膽管癌的診斷效能優(yōu)于血清CEA，且肝癌患者的血清外泌體CEA水平顯著高于膽管癌，可作為鑒別診斷的指標(biāo)。分析原因可能為：(1)正常人血清外泌體CEA經(jīng)胃腸道進(jìn)行代謝，因此血清外泌體CEA水平較低；但腫瘤患者的血清外泌體CEA經(jīng)血液和淋巴循環(huán)，由于功能受阻，進(jìn)而導(dǎo)致血清外泌體CEA水平明顯升高[13]。(2)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞排列極性消失，患者血清中CEA水平呈陽性[14]。(3)肝癌患者的肝臟功能較差，肝細(xì)胞的攝取、代謝能力下降，肝內(nèi)血液分流致使CEA直接入血，血清CEA增加，且高于肝膽癌。因此血清CEA水平可作為肝癌和膽管癌的診斷指標(biāo)[15]。

綜上所述，血清外泌體CEA對(duì)肝癌和膽管癌的診斷效能優(yōu)于血清CEA，且肝癌的血清外泌體CEA水平高于膽管癌，血清外泌體CEA可作為肝癌和膽管癌鑒別診斷的有效指標(biāo)，值得在臨床推廣。