基于網絡藥理學和分子對接技術探討經典名方瀉白散治療肺炎的潛在作用機制＊

向澤棟 ，李 震 ，張 兵 ，張宏萌 ，王少平 ，張加余 ，于海濤 ，代 龍 ，高 鵬

（1.山東中醫藥大學藥學院濟南250355；2.山東省食品藥品審評查驗中心濟南250014；3.濱州醫學院藥學院煙臺264003；4.山東禹澤藥康產業技術研究院有限公司德州251200）

肺炎是一種肺部出現發炎，以咳痰、胸痛、發熱及呼吸困難為常見癥狀的疾病。肺炎通常由細菌或病毒感染而引發，易感人群分布廣泛，自幼兒至老年全年齡段均有患病可能，感染時呼吸系統及全身癥狀強烈，嚴重影響患者工作和生活，為患者家庭及社會增加嚴重負擔[1]。2019年爆發的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）在全球范圍內造成嚴重影響，人類生命健康受到威脅，世界經濟受到重創，目前仍無特效藥出現，再次引起人們對肺炎疾病的關注與研究熱情[2]。因此，盡快研制開發對肺炎疾病安全、有效的藥物至關重要。

瀉白散始載于北宋時期錢乙所著《小兒藥證直訣》，“治小兒肺盛，氣急喘嗽”，入選2018年國家中醫藥管理局公布的《古代經典名方目錄（第一批）》（以下簡稱《目錄》），是歷史悠久，療效確切，沿用至今的治療肺熱咳喘的經典名方[3]。《目錄》中，瀉白散全方由桑白皮、地骨皮、甘草組成，方中桑白皮甘寒性降，專入肺經，清瀉肺熱；地骨皮甘寒入肺，清降肺中伏火；甘草甘平，養胃和中，配伍嚴謹，立法周全。現代臨床中，瀉白散被廣泛用于支氣管炎、肺炎等肺部疾病[4-5]。2008年以來，經典名方新藥研發“注冊簡化”相關政策陸續推出，符合要求的經方可免報藥效學及臨床研究資料，直接申報生產，但并不意味著經方的藥理作用無需研究，面對現代醫學高度精準、高度綜合的發展潮流，古代經典名方的研究只有越深入，才能獲得更高的社會認可。瀉白散雖有悠久的臨床應用歷史，但其治療肺炎疾病的作用機制尚不清楚，限制了瀉白散的廣闊應用前景。

中藥具有多成分、多靶點、多作用通路的特點，對疾病起到較好治療效果的同時，其成分分析、機制闡釋卻成為難點。網絡藥理學具有整體性、系統性的特點，通過構建“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網絡，闡明中藥復雜體系的潛在作用機制，與中醫藥整體觀、辨證論治理念相符，是推動中醫藥作用機制深入研究，擴大中醫藥臨床適應癥的有力工具，已被成功用于多種中藥復方潛在作用機制的探索與闡明[6-7]。本文首次利用網絡藥理學和分子對接技術，以整體的視角闡明瀉白散治療肺炎疾病多靶點、多通路的復雜分子機制，以期為瀉白散臨床治療肺炎疾病提供理論依據，為瀉白散臨床藥方與現代制劑的一致性評價提供新的視野，促進瀉白散“由方變藥”的研究進程，為肺炎疾病新藥研發提供借鑒與參考。

1 方法

1.1 瀉白散活性成分的獲取

以“地骨皮”、“桑白皮”、“甘草”為關鍵詞，通過中藥系統藥理數據庫及分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）和中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）提取各味中藥活性成分[8-9]。TCMSP篩選條件設置為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL≥0.18）；BATMAN-TCM篩選條件設置為截止分數（Score cutoff）=20、調整后P值=0.05。

1.2 瀉白散活性成分作用靶點和肺炎靶點的獲取

通過TCMSP和BATMAN-TCM獲取活性成分作用靶點的信息，使用Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）將相關蛋白靶點名稱轉換成基因名稱。利 用DisGeNET數 據 庫（https://www.disgenet.org/search）和Gene Cards數據庫（https://www.genecards.org/）[10-11]，以Pneumonia為關鍵詞進行檢索，對兩數據庫靶點取交集，獲取肺炎相關靶點。采用Venny 2.1工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）篩選得到瀉白散活性成分與肺炎共同靶點，用Cytoscape 3.6.0軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及關鍵靶點篩選

將1.2中獲取的共同靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/）進行蛋白互作（Protein Protein interaction,PPI）分析[12]，限定物種為“Homo Sapiens”(即人類)，選擇隱藏游離靶點，設置最低互作分值（minimum required interaction score）為0.9，構建PPI網絡。將獲得的PPI網絡數據導入Cytoscape 3.6.0軟件，利用Network Analyzer插件進行拓撲學分析，以節點連接度（degree）的2倍中位數，緊密中心度（Closeness Centrality,CC）和間距中心度（Betweenness centrality,BC）的中位數為卡值，選擇同時滿足3個卡值的靶點作為關鍵靶點。

1.4 瀉白散作用于肺炎的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將1.3中篩選得到的關鍵靶點導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物種為“Homo Sapiens”，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，利用微生信數據分析網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）對結果進行可視化處理。

1.5 瀉白散作用于肺炎的成分與核心靶點的分子對接

從Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和Chemspider數 據 庫（http://www.chemspider.com/）下載瀉白散活性成分的SDF格式文件，經Chem3D軟件轉化為Mol2格式文件，從Protein Data Bank數據庫（PDB,https://www.rcsb.org/）獲取PPI網絡中核心靶點的3D結構的PBD格式文件（CXCL8（PDB:6N2U）；IL6（PDB:1IL6）；IL1B（PDB:5R86）；TNF（PDB:1TNF）；IL4（PDB:1BBN）；IL13（PDB:3LB6）；IL10（PDB:2H24）；NFKB1（PDB:2DBF）），導入PyMol軟件去除水分子和異質分子。利用AutoDock Tools1.5.6 子對接模擬軟件對蛋白質進行添加氫原子等操作，再將化學成分和靶點文件均轉化為pdbqt格式的文件，運用Grid模塊設置蛋白原配體為對接盒子中心，格 點 盒 子 尺 寸 大 小x×y×z設 定 為40×40×40，Spacing(angstrom)設置為1.000，導出中心格點盒子的中心x，y，z參數值。利用AutoDock Vina軟件將受體（靶點）與配體（化學成分）進行半柔性對接，結合能小于0 kJ·mol-1表明受體和配體具有自發結合潛力，結合能≤-5.0 kJ·mol-1說明化學成分與靶點對接效果較好。

2 結果

2.1 瀉白散活性成分及與治療肺炎靶點預測

通過TCMSP和BATMAN-TCM，檢索到有靶點信息的地骨皮活性成分14種，桑白皮活性成分39種，甘草159種，共212個活性成分和1448個靶點。通過DisGeNET和Gene Cards，檢索到191個肺炎靶點。利用Venny 2.1對活性成分靶點與肺炎靶點取交集后，共得到53個共同靶點，即為瀉白散治療肺炎的潛在靶點（圖1）。

圖1 瀉白散活性成分靶點與肺炎靶點Venn圖

2.2 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

如圖2所示，利用Cytoscape 3.6.0軟件構瀉白散治療肺炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，網絡中共有活性成分節點74個，靶點節點53個，節點間相互作用的邊272條。按節點的度排序，排名在前的活性成分有槲皮苷、7,8-二氫-3-甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-2(6H)-酮、四氫巴馬汀、葫蘆巴堿、血根堿、山奈酚等成分，化學成分相關信息見表1。

表1 瀉白散治療肺炎活性成分Top 10

圖2 瀉白散治療肺炎的藥物-成分-靶點-疾病圖

2.3 PPI網絡構建及關鍵靶點篩選

將瀉白散的53個作用靶點導入STRING數據庫進行PPI分析。利用Cytoscape 3.6.0軟件進行處理，結果如圖3，在網絡中有44個節點和262條邊，通過拓撲學分析，設置3個卡值degree≥10，CC≥0.4407，BC≥0.0044，選擇滿足以上三個卡值的節點為關鍵靶點，共篩選得到白細胞介素-6（IL6）、白細胞介素-6（CXCL8）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1β（IL1B）、白細胞介素-10（IL10）、核因子NF-κBp105亞基（NFKB1）、白細胞介素-4（IL4）、補體C3（C3）、白細胞介素-13（IL13）等關鍵靶點。將關鍵靶點導入STRING數據庫進行PPI分析，利用Cytoscape 3.6.0軟件進行處理，在網絡中有9個節點和54條邊，靶點相關信息見表2。

表2 瀉白散治療肺炎關鍵靶點

圖3 瀉白散治療肺炎PPI網絡及關鍵靶點篩選

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過DAVID對關鍵靶點進行GO功能富集分析（P<0.05），共得到90個條目，其中生物過程87條，細胞組成3條，分子功能3條，按P值排序取前20條作圖（圖4）。瀉白散治療肺炎可能涉及炎癥反應（inflammatory response）、免疫反應（immune response）、細胞因子活性（cytokine activity）、序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正向調節（positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、細胞對脂多糖的反應（extracellular space）等生物過程。通過DAVID對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析（P<0.05），共得到41個信號通路，按P值排序取前20條作圖（圖5）。瀉白散可能通過炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease(IBD)）、百日咳（Pertussis）、美洲錐蟲病（Chagas disease(American trypanosomiasis)）、軍團菌病（Legionellosis）等發揮治療肺炎的作用。

圖4 瀉白散治療肺炎關鍵靶點GO功能富集分析氣泡圖

圖5 瀉白散治療肺炎關鍵靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對接

利用AutoDock軟件對degree前7的核心藥效成分和PPI網絡中degree前8的核心靶點進行分子對接模擬計算，如表5，對接結果顯示，藥效成分與核心靶點的最低結合能均小于0 kJ·mol-1，說明預測的成分與靶點可以自發進行結合，其中TNF蛋白、IL4蛋白與各成分的對接結合能均小于-5.0 kJ·mol-1，CXCL8蛋白、IL6蛋白、IL1B蛋白、IL13蛋白和IL10蛋白與槲皮素、四氫巴馬汀、血根堿、山奈酚、β-谷甾醇的對接結合能小于-5.0 kJ·mol-1。將以上對接結果以PyMol軟件進行可視化，結果部分顯示如圖6，可見槲皮素與TNF在ARG103，GLU116，SER-99處形成氫鍵，3-甲基-6,7,8-三氫吡咯并[1,2-A]嘧啶-2-酮與TNF在PRO-117形成氫鍵，四氫巴馬汀與IL1B在SER-125處形成氫鍵，葫蘆巴堿和TNF在TYR-119處形成氫鍵，血根堿和IL13在ALA-204處形成氫鍵，山奈酚和TNF在SER-99,GLU-116處形成氫鍵，β-谷甾醇和CXCL8在GLU-70,GLN-59處形成氫鍵。

表3 瀉白散中核心活性成分與核心靶點分子對接結果

圖6 瀉白散成分與核心靶點分子對接結果（部分）。

3 討論

3.1 瀉白散治療肺炎主要成分分析

通過對瀉白散治療肺炎的網絡藥理學研究發現，瀉白散中有74個活性成分通過53個靶點對肺炎發揮治療作用，主要為3-甲基-6,7,8-三氫吡咯并[1,2-A]嘧啶-2-酮、四氫巴馬丁汀、葫蘆巴堿、血根堿等生物堿類，槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素等黃酮類成分。分子對接結果顯示槲皮素、血根堿、山奈酚、β-谷甾醇等與核心靶點IL8,IL6,IL4和TNF等均能實現自發結合，可能在治療肺炎過程中起到重要作用。槲皮素通過增強細胞活力，抑制細胞凋亡和減少炎性細胞因子IL6和TNF-α的產生，可以減輕肺成纖維細胞炎癥損傷[13]。脂質體槲皮素可以顯著降低支氣管肺泡中TNF-α，IL1B和IL6的表達水平，并明顯減輕肺纖維化區域和膠原蛋白沉積，表明槲皮素可以通過抑制炎癥細胞因子水平減輕博來霉素誘導的肺纖維化[14]。β谷甾醇可有效防止肺炎鏈球菌溶血素引起的細胞裂解[15]，同時能夠抑制轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導的肺泡上皮細胞慢性損傷，起到抗肺纖維化作用[16]。β谷甾醇具有抗炎作用，能夠抑制肺泡上皮細胞凋亡，對流感病毒引起的肺炎和急性肺損傷具有較好療效[17]。山奈酚能夠顯著降低急性肺損傷小鼠模型的肺水腫程度，降低血漿和肺組織中炎性細胞因子IL6，IL1B和TNF-α的水平[18]。血根堿可顯著降低髓樣細胞觸發性受體的表達，通過抑制NF-кB核易位，減輕肺炎支原體感染的A549人肺上皮細胞的炎癥反應[19]。本研究對瀉白散治療肺炎疾病活性成分的預測存在一定事實依據和文獻支持，預測結果具有現實指導意義。

3.2 瀉白散治療肺炎關鍵靶點分析

白細胞介素8（CXCL8或IL8）主要由單核-巨噬細胞產生，其氨基酸順序與多種炎癥因子有較高相似性，CXCL8的主要生物學活性是吸引和激活中性粒細胞，使中性粒細胞發生形態變化，定向游走到反應部位釋放活性產物，進而導致機體局部炎癥反應[20]。Chen等[21]提出在體外肺炎支原體以時間依賴的方式誘導支氣管上皮細胞產生CXCL8，使中性粒細胞活性明顯增加，推測肺炎支原體/CXCL8/中性粒細胞軸可能是肺炎支原體肺炎重要發病機制。白細胞介素6（IL6）作為促炎性細胞因子，可以刺激多種疾病的炎癥過程，如糖尿病，類風濕性關節炎，多發性硬化癥等[22]。細胞因子風暴是COVID-19重癥反應的重要部分，Zhang等[23]報道IL6在細胞因子釋放綜合征中起重要作用，推測阻斷IL6的信號轉導途徑可能成為治療重癥COVID-19患者的方法。白細胞介素1β（IL1B）是由炎癥小體受體NLRP3突變而產生的一種細胞因子，介導了多種自身炎癥綜合癥[24]。Gharebaghi等[25]報道通過降低IL1B表達水平，可以減輕COVID-19感染的病理表現。腫瘤壞死因子（TNF）主要由活化的巨噬細胞產生，能夠促進炎癥反應，引起類風濕性關節炎、炎癥性腸病等多種自身免疫性疾病[26]。Del Valle等[27]提出IL6和TNF-α血清水平是COVID-19疾病嚴重程度和死亡的重要預測指標，并在患者中得到驗證。可見，本研究預測的瀉白散治療肺炎疾病的關鍵靶點與諸多文獻報道具有一定的相似性，側面印證了研究結果的重要意義。

3.3 瀉白散治療肺炎關鍵靶點的GO功能富集分析

炎癥反應是機體對化學或物理因素引起的感染或傷害的直接防御反應，其特征為局部血管擴張、血漿深入細胞間質以及白細胞和巨噬細胞的積累。肺炎是指肺部受到病毒或細菌感染而出現發炎的癥狀[28]，關鍵靶點的生物過程分析集中于炎癥反應，為瀉白散治療肺炎提供了理論依據。免疫反應是指任何在生物體對潛在的內部或侵入性威脅做出調整反應時起作用的免疫系統過程[29]。Felsenstein等[30]提出新型冠狀病毒SARS-CoV2可以導致細胞死亡，并將病毒和細胞內成分釋放至細胞外，導致免疫細胞的富集、免疫復合物的產生，導致疾病后期的大量炎癥反應。Quinton等[31]認為肺炎發病和發展的過程取決于機體免疫力的保護能力和炎癥的損害程度，同時肺外組織（肝臟、骨髓等其他組織）的反應對機體抵御肺炎的侵襲至關重要，提示肺炎不只是單純肺部急性感染，而是由機體多種生理系統參與并相互作用的復雜病癥。細胞因子活性是指與受體發生相互作用以影響受體活性的細胞因子的活性，能夠控制組織和細胞的存活、生長、分化和功能[32]。Zbinden-Foncea等[33]提出嚴重COVID-19患者經歷了細胞因子風暴綜合征，IL6、IL10和TNF-α等細胞因子表達水平的激增對肺炎病情的加深有重要影響。因此，瀉白散可能通過介導和調節機體炎癥反應、免疫反應、細胞因子活性等實現對肺炎疾病的治療。

3.4 瀉白散治療肺炎關鍵靶點的KEGG通路富集分析

Mateer等[34]指出炎癥性腸病的常見并發癥為支氣管擴張、慢性支氣管炎等肺部疾病，推測功能失調的免疫細胞歸巢、全身性炎癥和腸道微生物失調等為炎癥性腸病誘導的肺炎的發病機制。Xu等[35]提出肺炎是百日咳的并發癥，在男性幼兒的百日咳病程的前兩周內易發生肺炎。Paddock等[36]對百日咳患者的肺組織病理學檢查表明白細胞明顯增多，且多在小肺動脈、靜脈和淋巴管中聚集，提示百日咳對肺炎的發生發展有重要影響。軍團菌通過感染機體肺泡巨噬細胞，破壞肺部細胞信號轉導途徑，導致嚴重的肺炎[37]。因此，瀉白散可能通過參與炎癥性腸病、百日咳、軍團菌病等多種通路，到達治療肺炎疾病的目的。

綜上，本研究首次基于網絡藥理學和分子對接技術，構建了“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網絡，探討了瀉白散治療肺炎疾病的作用機制，結果表明瀉白散治療肺炎疾病的活性成分可能有槲皮素、血根堿、山奈酚、β-谷甾醇等，它們可能作用于白細胞介素8（IL8）、白細胞介素6（IL6）、白細胞介素1β（IL1B）、腫瘤壞死因子（TNF）等靶點，通過調節炎癥反應、免疫應答、細胞因子活性等過程，參與炎癥性腸病、百日咳等通路，對肺炎起到治療作用。本文為中醫經典名方的復雜分子機制研究提供網絡藥理學和分子對接研究思路，為從整體觀出發闡明瀉白散治療肺炎疾病的藥效物質基礎和作用機制提供參考，為經典名方與現代制劑的一致性評價提供作用機制的研究方法，但本研究的部分預測結果仍需進一步通過細胞、動物實驗驗證，以完善相關機制研究，從而推動經典名方瀉白散新藥研發和應用進程。