基于網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接方法探討黃山藥干預冠心病的作用機制研究＊

但文超，劉紅旭，何慶勇，婁 妍2，，蔣燕君2，，連妍潔2，＊＊

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京100053；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京100029；3.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京100010；）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）是由動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起管腔狹窄，導致心肌缺血、缺氧或壞死，又稱缺血性心臟病，是最常見的心血管疾病之一。隨著社會人口年齡結(jié)構(gòu)分布的改變，冠心病發(fā)病率逐年攀升，根據(jù)《中國心血管病報告2018》概要[1]，估算我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中冠心病患者數(shù)量高達1100萬，居各類心臟病之首。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）評估報告表明[2]，截止2030年全球?qū)⒂?3.3億人左右死于冠心病。心血管疾病，尤其是缺血性心臟病，仍然是世界范圍內(nèi)主要的死亡原因和長期發(fā)病率的重要原因[3]。可見，世界人群的冠心病患病率已成重大公共衛(wèi)生問題。

黃山藥為我國特有的薯蕷科薯蕷屬植物，是國家級（五類）新藥地奧心血康軟膠囊（成都地奧制藥集團有限公司，批號0603024，DAXXK）的主要藥源。地奧心血康具有活血化瘀、行氣止痛、宜痹通陽等功效，有關(guān)臨床研究顯示地奧心血康可緩解患者心肌缺血癥狀，并改善心臟血流動力學指標[4-7]，部分基礎(chǔ)研究亦顯示地奧心血康具有抗氧化損傷、抑制細胞凋亡、降低炎性因子的表達[8-10]，延長凝血酶原時間和抑制纖維蛋白[11]的作用。有Meta分析結(jié)果顯示，地奧心血康膠治療冠心病心絞痛，在單用或與常規(guī)藥物聯(lián)合運用的情況下，在提高總療效、改善心電圖方面具有更大的優(yōu)勢，且藥物安全性較好[12]。研究表明[13]黃山藥含有多種甾體皂苷類物質(zhì)及活性多糖等有效成分，具有改善心血管功能、抗血小板聚集、降血脂等多種藥理作用，但目前對于黃山藥干預冠心病的藥理學作用機制的研究相對匱乏。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是運用高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化及分析技術(shù)揭示藥物、靶點、疾病之間復雜的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析、預測藥物的藥理學機制的研究方法[14]。李梢教授等[15]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學從生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控角度對中藥方劑現(xiàn)代研究的方證關(guān)系、病證關(guān)系和方劑的多靶點作用等問題進行了探索并取得了有意義的結(jié)果。分子對接是預測蛋白與配體親和能力和結(jié)合模式的強有力的工具，對于給定的蛋白質(zhì)和配體（蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子），可通過預測它們的結(jié)合模式及結(jié)合自由能，進而對其功能及作用機制進行研究。基于分子對接方法的虛擬篩選已成為針對特定靶蛋白藥物研發(fā)的必備流程之一[16]。

為更好地了解黃山藥干預冠心病的作用機制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接的方法，在分子的水平上，從化學成分、作用靶點和信號傳導通路對黃山藥干預冠心病的作用機制進行系統(tǒng)研究，以期為進一步揭示黃山藥的藥理作用機制提供理論基礎(chǔ)，研究流程圖見圖1。

圖1 研究流程圖

1 材料與方法

1.1 黃山藥相關(guān)成分及靶點篩選

通 過ETCM（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine）數(shù)據(jù)庫[17]（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）并結(jié)合查閱文獻對黃山藥的化學成分信息進行收集，將收集的化學成分逐一通過Pubchem數(shù)據(jù)庫[18]獲得成分的分子結(jié)構(gòu)圖并以3Dsdf的格式存儲。將所獲取化合物結(jié)構(gòu)輸入SwissADME平臺[19]（http://www.swissadme.ch/）。設(shè)置潛在核心化合物的標準為：①腸胃吸收（gatrointestinal absortion;GIabsortion）為“High”，表明成分具備良好口服生物利用度，可被吸收②設(shè)置5類藥性預測（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結(jié) 果 中 有2個 及2個 以 上 為“Yes”。其后通過文獻核查根據(jù)篩選標準所排除的化合物，若化合物藥理作用明顯且與研究主題相關(guān)，仍予以納入，最終獲得研究主題相關(guān)的潛在化合物。再利用基于藥效團匹配法的PharmMapper數(shù)據(jù)庫[20]（http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/index.php）獲取潛在化合物的靶點，選擇Normalized Fit Score（NF）≥0.9的靶點蛋白，并根據(jù)已發(fā)表的藥物相關(guān)成分文獻報道，補充未預測到的活性化合物的已知靶點。

1.2 冠心病相關(guān)靶點篩選

為保證數(shù)據(jù)的準確性與全面性，以“coronary heart disease”、“coronary disease”“coronary atherosclerotic heart disease”“CHD”等冠心病相關(guān)名詞為關(guān)鍵詞，搜索GeneCards數(shù) 據(jù) 庫[21]（https://www.genecards.org）、DisGeNet數(shù) 據(jù) 庫[22]（http://www.disgenet.org/home/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）數(shù)據(jù)庫[23]（http://www.omim.org）、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫[24]（https://www.drugbank.ca/）以獲得冠心病核心靶點。其中DRUGBANK數(shù)據(jù)庫基于臨床試驗藥物證據(jù)構(gòu)建而成，提供了豐富的藥物數(shù)據(jù)與全面的藥物靶標信息。OMIM、GeneCards、DisGeNet數(shù)據(jù)庫基于文獻構(gòu)建，各個數(shù)據(jù)庫之間各有優(yōu)勢、相互補充。將上述數(shù)據(jù)庫所獲取的靶點，刪除重復值后進行合并。再根據(jù)文獻報道補充未預測到的活性成分的已知靶點。使用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[25]（https://www.uniprot.org）將疾病靶點與藥物成分的潛在靶點統(tǒng)一規(guī)范為Gene Symbol，其后將兩者進行映射，以獲得黃山藥潛在干預冠心病的靶點。

1.3 黃山藥成分-冠心病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）是指從生物化學，信號轉(zhuǎn)導和遺傳網(wǎng)絡(luò)的角度研究化合物和疾病相關(guān)蛋白質(zhì)分子之間的相關(guān)性。為闡明靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將上述靶點上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫[26]（https://string-db.org），選擇物種為“智人”，設(shè)置靶點關(guān)聯(lián)的置信度為0.40，以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并通過CytoScape3.7.2軟件[27]制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoScape3.7.2中的MCODE插件[28]對蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系進行分析，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊并分析相關(guān)功能。

1.4 黃山藥成分與冠心病靶點GO功能富集和KEGG通路富集

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將“1.4”項下的交集靶點與KEGG富集出生物通路的相互作用信息與“1.2”項下篩選出的藥物成分與交集靶點合并，上傳到Cytoscape3.7.2中構(gòu)建出藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoScape3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)判斷核心靶點及干預冠心病的主要活性成分。

1.6 分子對接評估

選擇分析得到黃山藥成分-冠心病靶點網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名為前6的靶點。通過RCSB數(shù)據(jù)庫[30]（htp://www.rcsb.org/pdb）下載靶點蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，并以pdb格式進行保存。將候選化合物的3D化學結(jié)構(gòu)通 過Open Babel3.1.1[31]（http://openbabel.org/wiki/Main_Page）轉(zhuǎn)換為pdb格式文件。采用Autodock Tools1.5.6[32]（http://autodock.scripps.edu/resources/tools）進行除水、加氫，計算Gasteiger電荷，儲存為pdbqt格式文件。對潛在核心成分配體進行能量最小化處理，賦予配體原子類型、計算電荷，儲存為pdbqt格式。利用MOE2019[33]進行分子對接操作，以對接評分Affinity來篩選結(jié)合活性較好的活性成分與靶點，其中對接評分Affinity<-4.25 kcal·mol-1可認為配體與靶點之間具有結(jié)合活性，得分<-5.0表明結(jié)合活性較佳，得分<-7.0 kcal·mol-1兩者之間有強烈的對接活性[34]。

2 結(jié)果

2.1 黃山藥的主要活性成分靶點預測結(jié)果

綜合查閱文獻[35-39]，包括2015年版《中華人民共和國藥典》（第十版）、高效液相色譜法研究、綜述進展等共獲得黃山藥相關(guān)的30種化合物結(jié)構(gòu)，其有效成分主要為甾體皂苷類物質(zhì)，包括偽原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、異螺甾烷醇類皂苷、呋甾烷醇類及其他類皂苷等成分，還包括少數(shù)非甾體皂苷成分，如棕櫚酸。通過SwissADME篩選出11種活性最高的成分，結(jié)構(gòu)見表1。利用PharmMapper預測并選擇NF≥0.9的靶點，去除所有重復基因后共計139個預測靶點。

表1 黃山藥11種活性最高的成分

續(xù)表

2.2 黃山藥干預冠心病相關(guān)靶點獲取

在Genecards數(shù)據(jù)庫中得到冠心病相關(guān)作用靶點6810個，選擇相關(guān)度得分Score≥20.48的靶點作為冠心病的潛在靶點，獲得1703個相關(guān)靶點。結(jié)合DisGeNet、OMIM、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，除重后合并，最終得到1975個冠心病相關(guān)靶點。將黃山藥有效成分的139個靶點與1975個冠心病相關(guān)靶點取交集，獲得62個共同靶點，并通過R3.6.1繪制VENN圖（圖2）。

圖2 藥物靶點和疾病靶點VENN圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將62個交集靶點上傳至String11.0數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)信息并利用Cytoscape 3.7.2重新構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。得到PPI網(wǎng)絡(luò)后，運用CytoScape3.7.2中的MCODE插件，對PPI網(wǎng)絡(luò)進行進一步分析，得到潛 在Module（圖4），推 測MPK1、MPK8、MPK14、PIK3R1等為主要靶點。根據(jù)P值，分別保留PPI網(wǎng)絡(luò)與Module中3個最佳評分的生物學進程并描述其功能（表2）。

圖3 黃山藥-冠心病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 黃山藥-冠心病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中的Module

表2 黃山藥-冠心病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)功能描述

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集

利用Bioconductor中ClsuterProfiler程序包對黃山藥干預冠心病相關(guān)靶點進行生物信息分析（圖5）。圖7-A表明黃山藥干預冠心病主要涉及生物學過程的對類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（regulation of inflammatory response）、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）。圖7-D為KEGG通路分析結(jié)果，圖中顯示了黃山藥干預冠心病排名前20的信號通路，關(guān)鍵通路包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、PI3K-Akt信 號 通 路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

圖5 黃山藥主要成分潛在靶點的富集分析

2.5 黃山藥成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運用CytoScape3.7.2構(gòu)建“黃山藥成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過其內(nèi)置工具分析黃山藥干預冠心病靶點網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。如圖6所示，此網(wǎng)絡(luò)由62個節(jié)點和215條邊構(gòu)成，紅色節(jié)點代表潛在靶點，橙色節(jié)點代表黃山藥中的活性成分，綠色節(jié)點代表潛在信號通路，連線代表三者之間的相互作用，圖中節(jié)點面積越大、顏色越深表明其對冠心病的影響越大。

圖6 黃山藥干預冠心病成分-靶點-通路圖

Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析中，每種活性成分對應(yīng)多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現(xiàn)了黃山藥內(nèi)含的多種成分，可能通過多靶點干預冠心病。其中HSY-3（新甾體皂苷）度值為15，介度為0.127，緊密度為0.480，預測新甾體皂苷為黃山藥干預冠心病的主要成分，其次為HSY-8（胡蘿卜苷）（連接度為14，介度為0.107，緊密度為0.473），HSY-5（progeninⅢ）（連接度為8，介度為0.0446，緊密度為0.414）（表3）。MAPK1、MAPK10、MAPK8、MAP2K1、PIK3R1靶點基因的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度排位靠前，連接度分別為22、16、15、15、14，預測促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族為黃山藥干預冠心病的核心靶點，PIK3R1、EGFR、RAC1、PRKACA、IGF1亦為相對重要的靶點（表4）。由表5可知，通路與通路之間是通過共有靶點連接而非獨立分開的，表明黃山藥可通過各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到干預冠心病的作用。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料以[例(%)]表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表3 黃山藥主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

表4 黃山藥主要活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

表5 黃山藥干預冠心病靶點通路富集結(jié)果

2.6 分子對接篩選

將11種核心澘在化合物與6個核心靶點ALB（PDBID:6RQ7）、EGFR（PDBID:5GTY）、MAPK1（PDBID:1PME）、SRC（PDBID:4U5J）、IGF1（PDBID:3LVP）、CASP3（PDBID:1NMS）進行分子對接，最終得到60組受體-配體對接結(jié)果。在60組受體-配體結(jié)果中，其 中Affinity<-5 kcal·mol-1的 組 合 共 有59組，Affinity<-7 kcal·mol-1的 有30組，占50%。在 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的組合有15個，平均值為-7.641 kcal·mol-1，其中對接得分最高的為：EGFR-新甾體皂苷（3β,26-二醇-25(R)-?5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷），分值為-8.728kcal·mol-1，對接得分最低的為ALB-panthogenin-B，分值為-6.551 kcal·mol-1，這表明所篩選的的潛在核心化合物與核心靶點之間可能具有較好的結(jié)合活性。網(wǎng)外45個組合排名前三的 組 合 有：daucosterol-ALB（-9.356 kcal·mol-1），trillin-EGFR（-9.051 kcal·mol-1），daucosterol-EGFR（-8.937 kcal·mol-1）。網(wǎng)外組合平均值為-7.080 kcal·mol-1，分值均小于-4.25 kcal·mol-1，提示均有良好的對接活性。對接結(jié)果可為今后進一步開展相關(guān)中藥及成分的實驗篩選設(shè)計提供數(shù)據(jù)支撐，分子對接結(jié)果見圖7，部分核心化合物對接模式見圖8。

圖7 分子對接結(jié)果

圖8 黃山藥部分核心化合物分子對接模式

3 討論

祖國醫(yī)學中雖無冠心病的病名，但古代醫(yī)籍中早有其典型臨床表現(xiàn)的記載，當屬于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范疇，《素問》云：“心痹者，脈不通”。中醫(yī)認為氣滯、血瘀、痰濁、寒凝，以及氣血陰陽的不足為主要致病因素，進而導致心脈痹阻而發(fā)病，病變于心，屬本虛標實之證，活血化瘀法是治療冠心病的重要法則[40-42]。現(xiàn)代臨床研究表明[43]冠心病患者存在血液流變性異常，血流動力學改變，微循環(huán)障礙等病理改變，其主要病理學基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化和血脂代謝異常。黃山藥性溫，味微辛，可通過擴張冠狀動脈血管，減小血液黏稠度以及血小板的聚集率來改善血循環(huán)[44]，研究顯示，以黃山藥為主要藥源的地奧心血康具活血化瘀、行氣止痛、擴張冠脈血管和改善心肌缺血等功效，廣泛運用于臨床干預心血管疾病。

3.1 潛在有效成分分析

地奧心血康主要成分為薯蕷皂苷元（diosgenin）和偽原薯蕷皂苷（pseudoprotodioscin）[45]。薯蕷皂苷元是一種重要的甾體皂苷元，廣泛存在于薯蕷科等多種植物中，楊柏等人研究發(fā)現(xiàn)[46]薯蕷皂苷元可抑制PARP/p53和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）表達而減輕冠心病模型豬的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。馬海英等[47]通過實驗證實薯蕷皂苷元在體外有明顯的抗血小板聚集活性。薯蕷皂苷元的分子結(jié)構(gòu)與雌激素類似，亦有基礎(chǔ)實驗[48]表明其能夠顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A），這種作用是經(jīng)由雌激素受體相關(guān)的PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)的。此外，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法初步篩選出黃山藥干預冠心病的主要活性成分尚有新甾體皂苷（3β,26-二醇-25(R)-?5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷）、胡 蘿 卜 苷(daucosterol)、延齡草苷（trillin）、panthogenin-A等。AS是導致冠心病主要危險因素，炎癥反應(yīng)是AS形成中的一個重要因素[49]，故降低炎癥反應(yīng)的作用更有利于減少AS形成，并起到保護心血管的作用。胡蘿卜苷是一種廣泛存在于植物中的植物甾醇糖苷，HUNG等[50]在研究胡蘿卜苷的藥理作用時，證實胡蘿卜苷可抑制MAPK、JNK等相關(guān)炎癥反應(yīng)信號通路的活化。阿司匹林作為冠心病的一級預防藥物[51]，具有抗血小板聚集的作用，可顯著減少主要心血管事件。KOO等[52]發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷抗2-5 μg·L-1膠原誘導的血小板聚集作用約為阿司匹林的2倍，證明胡蘿卜苷有良好的抗血小板聚集作用。NO可通過促使氧化應(yīng)激損傷、能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)發(fā)展發(fā)生等加重心肌損傷。延齡草苷具有明顯的抗高脂血癥和抗氧化作用[53]，有研究發(fā)現(xiàn)[54]其能抑制NO的釋放，同時減少誘導細胞死亡，降低TNF-α、IL-6、COX-2 mRNA等炎性基因的表達，并可通過上調(diào)Sirt1的表達、下調(diào)NF-Kβ和TNF-α的表達，從而提高抗氧化能力，降低炎癥因子損傷[55]。除此之外，存在一些尚未被報道的有效成分亦可能為黃山藥干預冠心病的主要有效成分，如3β,26-二醇-25(R)-?5,20(22)-二烯-呋甾-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、panthogenin-A等，預測這些有效成分的功效將成為未來研究黃山藥干預冠心病的潛在方向，其藥效學及作用機制有待進一步驗證。

分子對接結(jié)果顯示，黃山藥中的核心化合物胡蘿卜苷、延齡草苷、新甾體皂苷、progeninⅢ等與主要靶點（ALB、EGFR、SRC、MAPK1）的結(jié)合活性較強，這在側(cè)面反映了網(wǎng)絡(luò)預測結(jié)果的可靠性。故今后在設(shè)計相關(guān)基礎(chǔ)實驗或臨床研究時可重點關(guān)注胡蘿卜苷、延齡草苷、新甾體皂苷等在干預冠心病相關(guān)機制中的作用。

3.2 靶點分析

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學成分篩選、靶點預測和網(wǎng)絡(luò)分析，可發(fā)現(xiàn)占據(jù)網(wǎng)絡(luò)中心位置的主要為白蛋白（ALB）、表皮生長因子受體（EGFR）、有絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs），包 括MAPK1、MAPK2、MAPK8、MAPK10等，這些靶點在黃山藥干預冠心病的生物過程中可能起關(guān)鍵作用。既往研究表明[56]ALB減低可能是冠心病事件風險和短期死亡率增加的獨立危險因素。ALB有抑制血小板活化和聚集，減少血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用，在血小板誘導冠心病的發(fā)展過程中起到調(diào)節(jié)作用[57]，與冠心病嚴重程度的指標呈負相關(guān)[58]；EGFR分布于所有血管上皮細胞，可通過參與RAS/RAF/MEK/MAPK，PI3K/PDK1/AKT兩條主要途徑發(fā)揮干預細胞生長、分化、增殖等作用，EGFR與配體（EGF）特異性結(jié)合后可促進心血管系統(tǒng)中ROS的形成并有助于血管收縮，李偉新等[59]研究發(fā)現(xiàn)EGFR可能是肥胖相關(guān)心血管疾病的治療靶點，與心肌炎癥、纖維化、凋亡和功能障礙相關(guān)；MAPKs屬于酪氨酸激酶系統(tǒng)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可被激活[60]。MAPK1作為炎癥常用通路中的一員為重要的炎癥評價指標，與炎癥的嚴重程度有密切關(guān)系[61]，可參與冠心病的炎性反應(yīng)，還可影響冠心病的脂代謝和凝血功能[62]。MAPK8是MAPK信號轉(zhuǎn)導途經(jīng)中重要的信號分子，當機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，能夠誘導細胞凋亡，同時促進炎癥因子TNF-α、IL-1β的活化[63]。

3.3 生物富集分析

通過GO功能富集分析可知，生物學進程包括對類固醇激素的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)等，主要涉及內(nèi)肽酶活性、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合等方面的功能，通過KEGG富集分析可推斷，黃山藥干預冠心病的信號通路主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)，例如MAPK信號通路、雌激素信號通路、Ras信號通路、PI3K/Akt信號通路等。

全身炎癥是CHD的一個重要病理生理因素。在KEGG富集分析中，MAPK信號通路是富集基因最多的信號通路且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此推測MAPK通路可能是通過抗炎干預冠心病的關(guān)鍵通路。MAPK信號通路可介導細胞產(chǎn)生各種反應(yīng)，Logatkina等[64]發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路成分的增加可導致冠心病患者全血細胞持續(xù)炎癥激活。在MAPK信號通路中JUNK/p38MAPK通路是控制炎癥反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一，與細胞炎癥、凋亡、生長有關(guān)，其中p38MAPK與多種病理過程如心肌病變、心臟缺血/再灌注、動脈硬化的發(fā)生等相關(guān)[65]，激活p38MAPK信號通路可使血管平滑肌細胞從中膜進入內(nèi)膜并發(fā)生增殖，促進AS的發(fā)生和發(fā)展[66]。周茜等[67]研究表明通過促進MAPK通路中ERK的活化、減少促凋亡通路中JNK和p38MAPK的激活，可減輕心肌纖維化，從而保護心肌靶器官。

基礎(chǔ)研究顯示[68-71]雌激素可通過調(diào)節(jié)凝血功能、抗炎作用及動員血管內(nèi)皮細胞，并促進血管內(nèi)皮細胞缺血損傷后修復來實現(xiàn)保護血管內(nèi)皮細胞，以達到防止AS，保護心血管系統(tǒng)的作用。王宇等[72]研究顯示雌激素主要通過與其受體結(jié)合后激活包括PKB/Akt、ERK1/2、p38-MAPK在內(nèi)的信號通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡，保護心血管系統(tǒng)，從而防止As的發(fā)生。因此推測雌激素信號通路為黃山藥發(fā)揮抗炎、保護血管的一條潛在通路。

PI3K/Akt是調(diào)節(jié)心臟功能相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導通路，通過調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、血管再生、促進細胞能量代謝等影響冠心病的發(fā)生和發(fā)展[73-75]。Ravingerova等[76]通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路的級聯(lián)反應(yīng)對大鼠心臟具有保護機制。PI3K/Akt信號通路還可以使糖原合酶激酶-3（glycogensynthase，GSK-3）磷酸化，降低GSK-3的活性，增加心肌對葡萄糖的攝取和脂代謝能力，從而保護心臟[77]。在Ras信號轉(zhuǎn)導途徑中，Ras蛋白作為分子開關(guān)參與信息傳遞可激活下游信息傳遞途徑如MARK信號途徑、PI3K/Akt信號通路、GalGEF信號通路等，參與調(diào)節(jié)細胞代謝、凋亡、增殖和分化。由此可以推測Ras信號通路、PI3K/Akt信號通路等在黃山藥干預冠心病過程中亦發(fā)揮重要作用。

綜上所述，已有相關(guān)報道的和冠心病相關(guān)的生物通路主要與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)，提示黃山藥可能通過MAPK信號通路、雌激素信號通路、Ras信號通路、PI3K/Akt信號通路干預冠心病。

4 結(jié)語

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接的研究方法，通過靶點預測、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、GO富集分析和KEGG通路富集分析，提示黃山藥主要活性成分胡蘿卜苷、延齡草苷、新甾體皂苷等，可能通過ALB、EGFR、SRC、MAPKs等靶點，作用于MAPK、雌激素、Ras、PI3K/Akt等信號通路干預冠心病。需要注意的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學是依據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和已有實驗數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡(luò)的建模，由于原始實驗數(shù)據(jù)、圖譜信息來源于不同的實驗條件，故實驗存在一定的假陽性率和假陰性率[78]。本文基于理論層面對黃山藥干預冠心病的作用機制進行了預測分析，預測分析結(jié)果與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和實驗數(shù)據(jù)不盡相同，希望本分析結(jié)果可為下一步深入研究提供新的思路，也期待更為豐富的研究結(jié)果。后續(xù)研究團隊將持續(xù)關(guān)注黃山藥藥理研究進展，并在此基礎(chǔ)上進一步進行動物或細胞實驗，以深入探討黃山藥干預冠心病的靶點及機制。