電針經(jīng)p38 MAPK信號(hào)通路對坐骨神經(jīng)損傷大鼠脊髓中AQP1和AQP4表達(dá)的影響＊

宋安華，黎世貴，馮星源，于海波

（1.三亞市中醫(yī)院 三亞572000；2.深圳市中醫(yī)院 深圳518001）

周圍神經(jīng)損傷通常發(fā)生在道路交通事故、工業(yè)事故或家中受傷，臨床治療后很難完全恢復(fù)。神經(jīng)損傷通常會(huì)導(dǎo)致永久性的部分運(yùn)動(dòng)功能和感覺功能喪失，或兩者兼而有之[1]。由恢復(fù)不充分而導(dǎo)致的創(chuàng)傷后運(yùn)動(dòng)和感覺障礙會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，尋找新的促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后完全修復(fù)的治療方案尤為重要。針灸是非手術(shù)治療腰椎間盤突出癥的主要傳統(tǒng)中醫(yī)療法，是臨床治療腰間盤突出癥的有效方法之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，電針（electroacupuncture，EA）對腰間盤突出癥坐骨神經(jīng)損傷具有明顯治療效果[2]，但EA治療坐骨神經(jīng)損傷的分子機(jī)制還未知。研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白4（Aquaporin 4，AQP4）在大鼠坐骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛中具有重要促進(jìn)作用[3]。AQPs是一個(gè)小的整體膜蛋白家族，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)水的轉(zhuǎn)運(yùn)，對水的內(nèi)環(huán)境平衡有重要作用[4]。據(jù)報(bào)道，AQP1和AQP4在周圍神經(jīng)損傷模型中起重要作用[3,5]，但其相關(guān)作用機(jī)制尚不完全清楚。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一組能被不同的細(xì)胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p38 MAPK信號(hào)通路，能被炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激和生長因子激活來參與機(jī)體神經(jīng)損傷[6]。研究發(fā)現(xiàn)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞中p38MAPK的磷酸化能引發(fā)相關(guān)神經(jīng)損傷及感覺功能障礙[7]。因此，本研究提出電針修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷與AQPs的關(guān)系，通過構(gòu)建坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型，探討電針對坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)作用以及可能的分子機(jī)制。本研究是國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題子課題（2019YFC1712205）的延伸內(nèi)容，由該子課題提供經(jīng)費(fèi)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF清潔級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，鼠齡7-8周，體質(zhì)量（300±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）-2018-0011。大鼠分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在20-26℃，相對濕度40%-70%，更換新鮮空氣10次·h-1，光照循環(huán)條件12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。

1.2 藥品與儀器

p38MAPK抑制劑SB203580購自美國Promega公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL試劑購自美國Thermo公司；兔抗p38MAPK、pp38MAPK（Thr180/Thr182）、β-tubulin、AQP1和AQP4抗體購自英國ABCAM公司；BX60顯微鏡購自日本Olympus公司；7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；RM2235石蠟切片機(jī)購自上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；6805-A電針儀購自汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司；BL-410電生理系統(tǒng)BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由成都泰盟科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分成假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Model組）、電針組（EA組）、抑制劑組（SB203580組）和電針+抑制劑組（EA+SB203580組），每組12只。造模前1天，大鼠禁食，正常飲水。所有大鼠均經(jīng)腹腔注射50 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉，然后參照文獻(xiàn)[8]，采用鉗夾法構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，即將大鼠常規(guī)固定消毒后，沿著右側(cè)股后坐骨神經(jīng)干走向做切口，鈍性分離并暴露股骨中段坐骨神經(jīng)。用血管鉗鉗夾坐骨神經(jīng)10 s，放松10 s，重復(fù)3次，血管鉗扣第3齒，約5 kg鉗夾力，完成神經(jīng)擠壓后，復(fù)位受損的坐骨神經(jīng)，逐層縫合手術(shù)切口。其中sham組大鼠不進(jìn)行坐骨神經(jīng)鉗夾，僅暴露坐骨神經(jīng)。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[9]：造模30 min后，各組隨機(jī)選取2只大鼠測量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（motor nerve conduction velocity,MNCV）。若造模大鼠MNCV<20 m·s-1，則說明造模大鼠運(yùn)動(dòng)能力下降，坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型成功。

1.4 分組干預(yù)

EA組、SB203580組和EA+SB203580組分別于造模24 h后進(jìn)行電針或SB203580干預(yù)，其中EA+SB203580組同時(shí)進(jìn)行電針和SB203580干預(yù)。電針干預(yù)穴位為患側(cè)“環(huán)跳”穴[10]，即大鼠右側(cè)后肢股骨大轉(zhuǎn)子與尾骨、髂骨結(jié)合部連接線外1/3與內(nèi)2/3的交點(diǎn)處，待大鼠出現(xiàn)瞬間肌肉抽搐和足趾顫動(dòng)，“負(fù)極”刺入鼠尾正中，啟動(dòng)電針儀，設(shè)置電流強(qiáng)度2 mA，頻率2 Hz/100 Hz疏密波，持續(xù)15 min，每天1次，連續(xù)14天。SB203580干預(yù)即用50% DMSO溶解B203580，以0.5 μg·mL-1[11]劑量鞘內(nèi)注射10 μL，每天1次，持續(xù)14天。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 測定大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic Function Index,SFI）

于干預(yù)前以及干預(yù)后第7天和第14天分別測定各組大鼠SFI，將大鼠后足蘸墨水后，從自制足印行走箱（長50 cm、寬8 cm、高10 cm）一端走向另一端。每側(cè)留下4或5個(gè)足印，分別測量實(shí)驗(yàn)側(cè)足和正常側(cè)足足印的3個(gè)變量（足印長度、足趾寬度和中間足趾距離），根據(jù)Bain公式[8]計(jì)算得出SFI。

1.5.2 HE染色觀察大鼠損傷部位坐骨神經(jīng)病理學(xué)變化

干預(yù)14天后，腹腔注射50 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)造模切口暴露受損神經(jīng)，取3 mm損傷處遠(yuǎn)端神經(jīng)組織，立刻固定于10%甲醛中固定24 h。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟連續(xù)切片（厚約5 μm）等常規(guī)石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)制備過程后，進(jìn)行HE染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇至水，加入蘇木素染色5 min，流水沖洗5 min后，1%鹽酸乙醇分化20 s，蒸餾水洗滌10 s，加入0.5%伊紅染液復(fù)染3 min，蒸餾水洗滌30 s后，再經(jīng)脫水、透明，樹脂封片，置于顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)組織病理變化。

1.5.3 BL-410電生理系統(tǒng)測定大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度（Nerve Conduction Velocity,NCV）

干預(yù)14天后，參考文獻(xiàn)[12]操作步驟，經(jīng)造模切口，拆除縫合線，取已分離了的坐骨神經(jīng)，將兩個(gè)引導(dǎo)電極分別置于股神經(jīng)近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端，兩引導(dǎo)電極間的距離為1 cm，最后利用BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測各組大鼠NCV。

1.5.4 qRT-PCR檢測大鼠脊髓中AQP1和AQP4 mRNA表達(dá)水平

干預(yù)14天后，取各組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處近、遠(yuǎn)端相應(yīng)節(jié)段脊髓組織，利用TRIpure試劑提取組織總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過聚合酶鏈反應(yīng)和特異性引物擴(kuò)增cDNA，利用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR。PCR反應(yīng)條件：95oC 5 min，（40 cycles）95oC變性5 s，60oC退火20 s，72oC延伸15 s。特異性引物：AQP1 F 5'-CCTGCTGGCCATTGACTACA-3'，R 5'-TGGTTTGAGAAGTTGCGGGT-3'；AQP4 F 5'-TTG GACCAATCATAGGCGC-3'，R 5'-GGTCAATGTC?GATCACATGC-3'；β-tubulin F 5'-AATCCCCACCTT TTCTTACTCC-3'，R 5'-AAAGATGGAGGAGGTTCCC-3'。以β-tubulin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算AQP1和AQP4 mRNA相對表達(dá)水平。

1.5.5 Western blot檢測脊髓中p38MAPK、p-p38MAPK、AQP1和AQP4蛋白表達(dá)水平

干預(yù)14天后，取各組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處近、遠(yuǎn)端相應(yīng)節(jié)段脊髓組織置于EP管中，加入即用型苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）溶液后進(jìn)行超聲勻速裂解，將勻漿離心后收集的蛋白樣品按1：5比例加入上樣緩沖液混勻后，沸水浴5 min。使用BCA試劑盒檢測樣品蛋白濃度。用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分離蛋白樣品，每個(gè)孔25 μg蛋白。電泳完成后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。室溫下將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中2 h，然后加入一抗抗體兔抗p38MAPK（稀釋1∶2000）、p-p38MAPK（Thr180/Thr182）（稀釋1∶1000）、AQP1（稀釋1:2000）AQP4（稀釋1∶1000）和β-tubulin（稀釋1:1000）4oC過夜孵育，其中β-tublin為內(nèi)參蛋白。加入含0.1%吐溫20的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution+Tween 20,PBST）洗滌3次，每次5 min。在37℃下加入辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗孵育2 h。然后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ECL）試劑發(fā)光，并將其暴露在X射線膠片上。利用Image J軟件掃描并獲得蛋白條帶灰度值，樣品的目的蛋白相對表達(dá)量為目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白β-tublin灰度值的比值。

表1 各組大鼠SFI值比較（±s）

表1 各組大鼠SFI值比較（±s）

注：與Sham組比較，##P<0.01；與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用單因素方差分析和Turkey多重事后驗(yàn)分析各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用t檢驗(yàn)分析兩組之間的顯著差異。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）

干預(yù)前，與Sham組比較，Model組的SFI值顯著降低（P<0.01）；與Model組比較，EA組和SB203580組SFI值無顯著性改變（P>0.05）；與SB203580組比較，EA+SB203580組SFI值無顯著性變化（P>0.05）。干預(yù)后第7天和第14天，與Sham比較，Model組SFI值顯著降低（P<0.01）；與Model組比較，EA組和SB203580組SFI值顯著升高（P<0.01）；與SB203580組比較，EA+SB203580組SFI值無顯著性變化（P>0.05）。

2.2 大鼠損傷部位坐骨神經(jīng)病理學(xué)變化

Sham組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列規(guī)則、緊密有序。Model組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞腫脹、間質(zhì)水腫，細(xì)胞核發(fā)生皺縮或溶解，出現(xiàn)明顯炎癥浸潤。EA組和SB203580組大鼠坐骨神經(jīng)組織相較于Model組細(xì)胞腫脹較輕、組織結(jié)構(gòu)相對較規(guī)則和完整，炎癥浸潤散在組織中。EA+SB203580組大鼠坐骨神經(jīng)組織與SB203580組的差異不大。

2.3 大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度（NCV）的檢測

圖1 HE染色觀察大鼠坐骨神經(jīng)病理變化（×200）

與Sham比較，Model組大鼠NCV顯著降低（45.37±6.28 m·s-1vs11.60±4.98 m·s-1，P<0.01）；與Model組比較，EA組和SB203580組大鼠NCV顯著升高（11.60±4.98 m·s-1vs22.07±4.45 m·s-1，P<0.01；11.60±4.98 m·s-1vs29.46±3.21 m·s-1，P<0.01）；與SB203580組比較，EA+SB203580組大鼠NCV無顯著性變化（29.46±3.21 m·s-1vs30.25±5.26 m·s-1，P>0.05）。

2.4 電針對大鼠脊髓中AQP1和AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

與Sham比較，Model組大鼠脊髓中AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與Model組比較，EA組和SB203580組大鼠脊髓中AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與SB203580組比較，EA+SB203580組大鼠脊髓中AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平無顯著性變化（P>0.05）。

2.5 電針對大鼠脊髓中p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平的影響

與Sham比較，Model組大鼠脊髓p-p38MAPK/p38MAPK顯著升高（P<0.01）；與Model組比較，EA組和SB203580組大鼠脊髓p-p38MAPK/p38MAPK顯著降低（P<0.01）；與SB203580組比較，EA+SB203580組大鼠脊髓p-p38MAPK/p38MAPK無顯著性變化（P>0.05）。

3 討論

圖2 大鼠脊髓AQP1和AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)水平

針灸是一種中醫(yī)治療方法，已有2000多年的歷史。電針是一種改良的針灸技術(shù)，在周圍神經(jīng)損傷治療中已使用了幾十年。電針通過外源性電刺激，引起神經(jīng)細(xì)胞膜通透性發(fā)生劇變，導(dǎo)致相應(yīng)電化學(xué)改變，對損傷神經(jīng)的修復(fù)有積極作用，可以改善行為、電生理學(xué)和形態(tài)學(xué)[13-14]。因此，本研究通過電針刺激坐骨神經(jīng)損傷大鼠“環(huán)跳”穴，觀察其對坐骨神經(jīng)損傷大鼠的神經(jīng)恢復(fù)的療效及可能的機(jī)制。研究表明，直接電刺激損傷部位可加速坐骨神經(jīng)再生[15]。在神經(jīng)生長過程中應(yīng)用電場能直接影響神經(jīng)分支[16]。這些結(jié)果為電刺激對神經(jīng)損傷恢復(fù)具有積極作用提供了科學(xué)依據(jù)，并與本研究的功能和組織形態(tài)學(xué)評估結(jié)果一致。在本研究中，采用SFI方法進(jìn)行功能評估，在電針或抑制劑干預(yù)前、干預(yù)7天和14天時(shí)，測量五組大鼠的后爪印。通常大鼠神經(jīng)損傷一周后，SFI值逐漸下降[17]。臨床上NCV作為電生理檢查，是診斷神經(jīng)損傷類疾病和和判斷藥物療效的有效手段之一。本研究結(jié)果表明，坐骨神經(jīng)損傷后，損傷部位遠(yuǎn)端組織病理結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)松散和間質(zhì)水腫，出現(xiàn)明顯炎癥浸潤；SFI值和NCV明顯降低。電針刺激后，損傷部遠(yuǎn)端組織細(xì)胞腫脹和炎癥浸潤情況得到有效緩解，SFI值和NCV明顯升高，說明電針刺激損傷部位能有效緩解大鼠坐骨神經(jīng)損傷，促進(jìn)周圍神經(jīng)的恢復(fù)。

p38MAPK信號(hào)通路可由紫外線、滲透壓變化、生理應(yīng)激等通過3級激酶級聯(lián)反應(yīng)磷酸化激活p38蛋白，調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞存活以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK抑制劑能減輕坐骨神經(jīng)炎性疼痛大鼠模型中炎癥引起的痛覺異常[18]，磷酸化p38蛋白低表達(dá)對坐骨神經(jīng)損傷大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡有抑制作用[19]。這些數(shù)據(jù)說明p38MAPK通路活性對周圍神經(jīng)損傷疾病具有調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，脊髓中p38MAPK活性明顯升高，而電針刺激后，p38MAPK活性明顯降低，說明電針對坐骨神經(jīng)損傷的治療作用可能與p38MAPK信號(hào)通路活性的抑制有關(guān)。而且，p38MAPK抑制劑組（SB203580）也表現(xiàn)出明顯的治療效果，其療效比電針刺激更好，從側(cè)面印證了p38MAPK信號(hào)通路是坐骨神經(jīng)損傷后周圍神經(jīng)恢復(fù)的重要一環(huán)。另外，電針+SB203580組與SB203580組的檢測結(jié)果差異不顯著說明電針可能無法通過其他途徑改善坐骨神經(jīng)損傷，從反面驗(yàn)證電針可能是通過抑制p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用。AQPs作為定位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞膜上組成“孔道”，控制水的進(jìn)出，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，其中AQP1和AQP4是在神經(jīng)組織中表達(dá)較多的AQPs。研究發(fā)現(xiàn)，AQP1在缺氧損傷的雪旺細(xì)胞中異常高表達(dá)，與雪旺細(xì)胞水腫密切相關(guān)[3]。抑制AQP4可以減輕神經(jīng)損傷產(chǎn)生的病理性疼痛痛覺異常[4]，AQP4抑制劑還能有效治療大鼠脊髓損傷后脊髓水腫和組織損傷[20]。本研究結(jié)果表明，坐骨神經(jīng)損傷能引起脊髓AQP1和AQP4異常高表達(dá)，這與之前的研究結(jié)果一致。說明AQP1和AQP4參與了坐骨神經(jīng)損傷過程。電針刺激后，脊髓中AQP1和AQP4蛋白表達(dá)水平明顯降低。結(jié)合之前的研究結(jié)果，可以推測電針治療坐骨神經(jīng)損傷可能通過抑制p38MAPK信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制脊髓AQP1和AQP4蛋白表達(dá)水平，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡，緩解組織炎癥，保護(hù)神經(jīng)組織。

圖3 大鼠脊髓p-p38和p38蛋白表達(dá)水平

綜上所述，電針刺激能有效緩解大鼠坐骨神經(jīng)損傷，促進(jìn)周圍神經(jīng)組織恢復(fù)，這可能是由于電針刺激可以抑制p38MAPK信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞AQP1和AQP4的表達(dá)，防治神經(jīng)組織的水腫和炎癥反應(yīng)。