水蛭素對(duì)大鼠NRK-52E細(xì)胞尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響＊

趙應(yīng)學(xué)，黃思詩(shī)，梁紅，吳林秀，梁杏梅，周維海，甄漢深，黃敏琪，劉喜華＊＊

（1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院南寧530021；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院南寧530023；3.廣西科康科技集團(tuán)有限公司南寧530001；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南寧530001）

尿酸是人體內(nèi)嘌呤核苷酸的分解代謝產(chǎn)物，通常將血液中尿酸水平男性>420 μmol·L-1，女性>360 μmol·L-1定義為高尿酸血癥（Hyperuricaemia），高尿酸血癥常由嘌呤代謝紊亂、尿酸排泄減少所導(dǎo)致[1]。高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，雖然只有5-12%的高尿酸血癥患者會(huì)發(fā)生痛風(fēng)，但血液尿酸水平越高、持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，痛風(fēng)的發(fā)病幾率越高[2]。對(duì)高尿酸血癥的長(zhǎng)期治療有助于防止痛風(fēng)及其可能的腎臟、心臟或代謝并發(fā)癥的發(fā)作，其首選藥物是黃嘌呤氧化酶抑制劑，如別嘌呤醇[3-4]。但由于別嘌呤醇非選擇性抑制嘌呤和嘧啶的其他酶而引起諸多不良反應(yīng)，作為選擇性抑制黃嘌呤氧化酶的非布司他在臨床上的使用也會(huì)引起消化道、肝腎功能及心血管不良反應(yīng)[5]。因此，尋找具有較好降尿酸效果且不良反應(yīng)少的治療新策略對(duì)于高尿酸血癥及痛風(fēng)的治療具有重要意義。

金邊螞蟥為廣西壯族自治區(qū)特色壯藥，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金邊螞蟥及其活性成分水蛭素可有效降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，具有較好的抗痛風(fēng)作用[6-8]。但尚未從細(xì)胞水平探索水蛭素降尿酸的可能機(jī)制，因此，本研究以大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E為研究對(duì)象，檢測(cè)不同劑量水蛭素對(duì)腎細(xì)胞尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響，以期從細(xì)胞水平揭示水蛭素對(duì)尿酸排泄的影響。

1 材料

1.1 水蛭素制備

取金邊螞蟥活體（南寧市金海科康生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20180608），吸飽2%氯化鈉后置于容器中，加入硫酸鋅、乙醇混合液，使其吐出唾液，即為天然水蛭素提取液。將水蛭素提取液純化后制成粉末狀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%，凝血酶滴定約為500 ATU·g-1），蒸餾水稀釋成含200 ATU·g-1的水蛭素溶液。

1.2 細(xì)胞與試劑

大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑：DMEM（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），PBS、胰酶、CCK8溶液、Hoechst33258染色液、SDS、RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），黃嘌呤（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），TRIzol（美國(guó)Ambion公司），反轉(zhuǎn)錄試劑（寶生物工程（大連）有限公司），SYBR FAST qPCR Master Mix（美國(guó)KAPA Biosystems），氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Millipore公司），兔抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（Glucose transporter 9,GLUT9）抗體、兔抗尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Urate transporter，URAT1）抗體、兔抗GAPDH抗體、山羊抗兔IgG（武漢貝茵萊生物科技有限公司），兔抗有機(jī)陰離子運(yùn)輸?shù)鞍祝∣rganic anion transporter 1，OAT1）抗體（英國(guó)Abcam公司）。

1.3 儀器

DMIL LED型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），AMR-100型酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司），CFXConnect 96型熒光定量PCR儀、mini protean 3 cell型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E從液氮罐中取出，37°C水浴至凍存液完全融化，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管。1000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入1 mL DMEM懸浮細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入含5%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，按照1:2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 CCK8檢測(cè)水蛭素對(duì)細(xì)胞的毒性作用

收集對(duì)數(shù)期NRK-52E細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并分布于96孔板中，每孔180 μL，約5×103個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度（0、0.01、0.1、1、5和10 mg·mL-1）水蛭素處理24、48、72 h。取出細(xì)胞板，每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔于450 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率=（其他濃度水蛭素組OD值-0 mg·mL-1水蛭素組OD值）×100%。

2.3 細(xì)胞分組與處理

將NRK-52E細(xì)胞分為5組：①正常組：采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞；②黃嘌呤（Xanthine）組：培養(yǎng)基中加入200 μmol·L-1黃嘌呤（濃度由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選所得）培養(yǎng)細(xì)胞；③水蛭素低濃度（Low）組：培養(yǎng)基中加入0.01 mg·mL-1水蛭素培養(yǎng)細(xì)胞；④水蛭素中濃度（Medium）組：培養(yǎng)基中加入0.1 mg·mL-1水蛭素培養(yǎng)細(xì)胞；⑤水蛭素高濃度（High）組：培養(yǎng)基中加入5 mg·mL-1水蛭素培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.4 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)

收集各組細(xì)胞分布于12孔板中，加入1 mL 4%多聚甲醛固定20 min。棄固定液，PBS清洗2次，加入1 mL Hoechst33258染色液染色5 min。棄染色液，PBS清洗5次，加入1 mL PBS，于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中GLUT9、OAT1和URAT1 mRNA表達(dá)水平

取各組細(xì)胞沉淀（約1×106個(gè)）于1 mL TRIzol中于冰上進(jìn)行勻漿處理，12000 r·min-1離心10 min，加入氯仿、異丙醇提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：

2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中GLUT9、OAT1和URAT1蛋白表達(dá)水平

按照每1×106個(gè)細(xì)胞加入200 μL RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液的比例，裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE分離。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4℃封閉過(guò)夜。于濕盒內(nèi)孵育一抗（1∶1000），室溫1 h。洗膜，孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫1 h。洗膜，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，讀取蛋白條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用mean±SD表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 水蛭素處理NRK-52E細(xì)胞的濃度及時(shí)間篩選

CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算細(xì)胞增殖率，結(jié)果（圖1）顯示，同一時(shí)間點(diǎn)，隨著水蛭素濃度的升高，NRK-52E細(xì)胞增殖率降低，而同一濃度水蛭素處理48 h對(duì)細(xì)胞增殖率的抑制作用低于24 h，因此，選擇24 h為本次實(shí)驗(yàn)水蛭素處理NRK-52E細(xì)胞的時(shí)間。根據(jù)不同濃度水蛭素對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖率的影響，10 mg·mL-1處理下的細(xì)胞增殖率[（72.18±1.04）%]相較于其他濃度偏低，對(duì)細(xì)胞毒性作用較大，因此，為了在對(duì)細(xì)胞低毒性的情況下觀察不同濃度水蛭素對(duì)NRK-52E細(xì)胞的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中設(shè)置的水蛭素低、中、高濃度分別為0.01、0.1和5 mg·mL-1。

圖1 水蛭素對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖率的影響

3.2 水蛭素對(duì)NRK-52E細(xì)胞形態(tài)的影響

Hoechst33258染色觀察結(jié)果（圖2）顯示，正常組細(xì)胞核呈橢圓形，被淡染，存在個(gè)別亮藍(lán)色細(xì)胞碎片；黃嘌呤組細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞核碎裂增多，呈亮藍(lán)色的凋亡小體增多；水蛭素低、中、高濃度組的細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)橢圓形，細(xì)胞質(zhì)固縮、細(xì)胞碎片逐漸減少，提示水蛭素可改善黃嘌呤誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化及凋亡。

圖2 Hoechst33258染色觀察NRK-52E細(xì)胞形態(tài)

3.3 水蛭素對(duì)NRK-52E細(xì)胞GLUT9、OAT1和URAT1表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western bolt檢測(cè)結(jié)果（圖3-圖4）顯示，與正常組比較，黃嘌呤組細(xì)胞中GLUT9和URAT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），OAT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與黃嘌呤組比較，水蛭素低、中、高濃度組GLUT9和URAT1表達(dá)顯著減低（P<0.05），OAT1表達(dá)顯著升高（P<0.05），且高濃度組與低濃度組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示水蛭素對(duì)NRK-52E細(xì)胞尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT9、OAT1和URAT1）的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞GLUT9、OAT1和URAT1 mRNA表達(dá)水平

圖4 Western blot檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞GLUT9、OAT1和URAT1蛋白表達(dá)水平

表1 qRT-PCR引物序列表

4 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，無(wú)癥狀高尿酸血癥可預(yù)測(cè)高血壓、糖尿病、肥胖、慢性腎臟疾病等的進(jìn)展[9]。血尿酸濃度升高與代謝綜合征有關(guān)，加強(qiáng)高尿酸血癥的預(yù)防措施，可有效控制痛風(fēng)、肥胖等疾病風(fēng)險(xiǎn)[10]。黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下，氧化生成尿酸，當(dāng)尿酸濃度超出其溶解度時(shí)，尿酸析出形成尿酸鹽，沉積于關(guān)節(jié)及周圍組織中，從而引發(fā)痛風(fēng)[11]。目前，臨床上降低尿酸的藥物主要通過(guò)減少尿酸的產(chǎn)生、增加尿酸的排泄和促進(jìn)尿酸溶解來(lái)實(shí)現(xiàn)，常用藥物包括別嘌呤醇、非布司他、丙磺舒、苯溴馬隆等[12]。但西藥治療痛風(fēng)具有較多的不良反應(yīng)，限制了臨床應(yīng)用。本課題前期發(fā)現(xiàn)金邊螞蟥具有較強(qiáng)的抗痛風(fēng)作用，并為之申請(qǐng)專利（專利號(hào)：CN201410109937.2）。經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)水蛭素是金邊螞蟥抗痛風(fēng)的主要活性成分[7]，基于前期研究結(jié)果，從動(dòng)物水平探討了廣西壯族自治區(qū)特色壯藥金邊螞蟥活性成分水蛭素對(duì)高尿酸小鼠的降尿酸的作用[8]，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平進(jìn)一步研究水蛭素降尿酸的可能機(jī)制。本次研究采用黃嘌呤干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，發(fā)現(xiàn)黃嘌呤可破壞細(xì)胞形態(tài)，增加細(xì)胞的凋亡，而在水蛭素同時(shí)干預(yù)下的NRK-52E細(xì)胞形態(tài)逐漸正常，凋亡小體也逐漸減少，提示水蛭素可緩解黃嘌呤干預(yù)對(duì)NRK-52E細(xì)胞的損傷作用。

盡管飲食、遺傳或疾病導(dǎo)致的尿酸生產(chǎn)過(guò)量是高尿酸血癥的病理基礎(chǔ)，但實(shí)際上高尿酸血癥的主要原因是尿酸排泄量較低[13]。治療高尿酸血癥及痛風(fēng)的策略之一即為采用尿酸鹽抑制劑抑制從尿液中重新吸收尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[14]。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，尿酸濃度與GLUT9、OAT4、URAT1、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2）等轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因的單核苷酸多態(tài)性存在顯著相關(guān)性[13]。GLTU9和URAT1主要是在腎近曲小管對(duì)尿酸鹽的重吸收過(guò)程中起關(guān)鍵作用[15]。OAT1在腎臟尿酸排泄中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)腎臟GLUT9、OAT1、URAT1和胃腸道上OAT1、GLUT9的表達(dá)可對(duì)高尿酸血癥小鼠產(chǎn)生降尿酸作用[16]。Fang等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，增加OAT1和OAT3表達(dá)，降低GLUT9和URAT1表達(dá)，可減少大、小鼠高尿酸血癥模型的血清尿酸水平。在本次研究結(jié)果中，黃嘌呤處理NRK-52E細(xì)胞，增加了細(xì)胞中GLUT9和URAT1的表達(dá)，而OAT1表達(dá)減少，水蛭素的干預(yù)可逆轉(zhuǎn)黃嘌呤對(duì)NRK-52E細(xì)胞GLUT9、OAT1和URAT1表達(dá)的影響，即水蛭素可調(diào)節(jié)NRK-52E細(xì)胞尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平。

民族醫(yī)藥治療痛風(fēng)具有較好的療效，且毒副作用小，進(jìn)而受到人們?cè)絹?lái)越多的重視，但民族藥物的開(kāi)發(fā)也伴隨著一些問(wèn)題，譬如研究基礎(chǔ)薄弱，機(jī)制研究較少等，阻礙了民族醫(yī)藥的標(biāo)準(zhǔn)化與推廣[18]。本研究從細(xì)胞水平揭示了水蛭素對(duì)尿酸排泄的可能機(jī)制，推測(cè)水蛭素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮降尿酸作用。本課題組對(duì)壯藥金邊螞蟥及其活性成分水蛭素抗痛風(fēng)效果的研究已有較多的基礎(chǔ)，從動(dòng)物水平和細(xì)胞水平系統(tǒng)闡述水蛭素抗高尿酸血癥的作用及可能機(jī)制，為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效低毒的抗高尿酸血癥藥物奠定了一定的基礎(chǔ)，也為民族醫(yī)藥的開(kāi)發(fā)建設(shè)提供了更多的參考資料。