藏藥十二味翼首散治療“年仍奈”潛在機制的網絡藥理學研究＊

張豐榮，黎彩鳳，祝娜，張曉瑞，崔建枝，葛莎莎，王均琪，沙子珺，張方博，唐仕歡，黃秀蘭，李志勇，＊＊

（1.山東中醫藥大學中醫學院濟南250300；2.中央民族大學藥學院北京100081；3.江西中醫藥大學院士工作站南昌330004；4.山西中醫藥大學基礎醫學院太原030600；5.中國中醫科學院醫學實驗中心北京100700；6.中國中醫科學院中藥研究所北京100700）

藏醫學是祖國傳統醫學的重要組成部分，現存最早的藏醫典籍《月王藥診》中已存在瘟病及疫病等概念，藏醫《四部醫典》將傳染性、流行性疾病稱為“年仍奈”[1]，“年仍奈”即“疫病”，屬于熱病范疇，藏醫主要采取祛邪和扶正的治療方式，逐漸戰勝病邪，恢復人體正氣，最終使熱病治愈，如《甘露寶瓶》所載：“初期治‘年’病、中期清熱證、后期治‘隆’強體質”為治療原則，結合“三因制宜”以辨證施治[2]。藏族成藥十二味翼首草散具有消除瘟熱的作用，主治瘟病、時疫等癥，現代主要應用于瘟疫、流行性感冒、乙型腦炎痢疾、熱病發燒等疾病。2月23日，西藏自治區藏醫藥管理局印發《新型冠狀病毒感染肺炎藏醫藥防治方案（試行第二版）》提出在藏醫藥理論指導下的新冠肺炎預防和治療措施，十二味翼首草散被《方案》推薦用于防治新冠肺炎[3]。

細胞因子風暴（cytokine storm）是指機體感染微生物后引起體液中多種細胞因子如白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（IFN）、趨化因子（CXCL8）、集落刺激因子（CSF）和生長因子（EGF、VEGF）等迅速大量產生的現象[4]。甲型H1N1流感[5]、H7N9禽流感[6]、流感后肺炎[7]和埃博拉[8]等疾病均影響體內炎癥因子過度表達而出現“細胞因子風暴”。臨床一線救治專家發現新型冠狀病毒感染患者TNF-α，IL-6，IFN-γ等炎性細胞因子顯著升高，具有細胞因子風暴的特征[9]，高細胞因子血癥易致炎性物質聚集和滲出，引發多器官衰竭和急性呼吸窘迫，可能是導致新型冠狀病毒肺炎（以下簡稱“新冠肺炎”）重型、危重型患者死亡的重要原因[10]。

本文對藏醫“年仍奈”的研究以新冠肺炎為例，《四部醫典釋難》記載：“疫病是人體俱生微蟲與外界‘巴巴達’毒蟲相遇，侵入人體七正精和三穢物中引起的一種即刻奪取性命的兇猛疾病”[11]。新冠肺炎以發熱、干咳和乏力為主，并伴有流涕、咽痛和肌痛等癥，其病位在肺，由人體感受疫戾之氣，使正常“肺隆”紊亂失調[12]，其與體內原有生物之間產生相互對抗，導致急性炎癥反應，并涉及全身，最終引起所謂的疫病[1]，此過程可能導致體內的細胞因子風暴發生。藏醫辨證治療“年仍奈”通常采取三個階段，初期主要以“集熱平穩”的治療方法，發病中期以“散熱驅邪，抑制傳播”為主，后期治療采取“安撫身心，調養身體，防治并發癥”的治法[1]。網絡藥理學具有整合藥理學、系統生物學等多學科配合的優勢，適合中藥及民族藥多成分多靶點多通路的特點，用于系統地研究分子，細胞，組織等治療復雜疾病的藥物的作用機制[13]。本文借助現代網絡藥理學技術探究十二味翼首散抗細胞因子風暴的潛在機制與防治“年仍奈”的不同階段相結合，使傳統藏醫防疫療法與現代網絡靶點之間建立相關聯系，為后續研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 十二味翼首散化學成分和靶點庫的構建

檢索中藥系統藥理數據庫（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）和化學專業數據庫（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），收集十二味翼首散中“翼首草”、“角茴香”、“莪大夏”、“麝香”、“檀香”、“紅花”、“牛黃”、“安息香”的化學成分。從中國知網和PubMed數據庫收集“榜嘎”、“黑草烏葉”、“五靈脂”、“石灰華”的化學成分。根據SWISSADME（http://www.swissadme.ch/）篩選腸吸收（GI）為high[14]，類藥性（DL）指標中含有兩個或兩個以上為YES的化合物[15]，構建十二味翼首散候選活性成分數據庫。十二味翼首散的化學成分通過使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫對其驗證并轉化為標準的Canonical SMILES格式，隨后導入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫[16]，設置物種屬性為“homo sapiens”，收集并構建活性成分的候選靶點庫。

1.2 十二味翼首散候選靶點通路注釋分析

利用STRING 11.0（https://STRING-db.org）數據庫對十二味翼首散的靶點蛋白進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，通過Omicshare（http://www.Omicshare.com/tools/index.php/）數據平臺對富集結果進行可視化處理，取P<0.05的前20個結果條目，得到GO及KEGG信號通路氣泡圖。

1.3 新冠肺炎疾病靶點庫及PPI網絡的構建

在GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）中以“2019-nCoV”、“Novel Coronavirus Pneumonia”為關鍵詞檢索新型冠狀病毒肺炎的疾病相關基因。將十二味翼首散靶點與新冠肺炎靶點分別導入VENNY在線工具，生成VENN圖。基于上述交集分析結果，利用STRING 11.0數據庫（https://string-db.org/）和Cytoscape 3.6.0軟件中構建十二味翼首散與新冠肺炎的交集靶點相互作用網絡（PPI網絡），設置Confidence（Score）cutoff值為0.50，根據“Degree”、“ClosenessCentrality”和“BetweennessCentrality”的中位數進行篩選，以大于3倍中位數的靶點篩選為核心靶點，進行可視化展示。

1.4 網絡可視化及基因功能富集分析

使用Cytoscape 3.6.0的插件MCODE，設置“Degree Cutoff”值 為2，“Node Score Cutoff”值 為0.2，“K-Core”值為2，“Max.Depth”為100，導入十二味翼首散與新冠肺炎的交集靶點PPI網絡，進行聚類分析。將聚類的結果導入ClueGO，選擇“Homo Sapiens”，設置P<0.05，進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。通過Cytoscape 3.6.0構建十二味翼首散的“藥物-活性成分-靶點-通路-功效”關系網絡。

2 結果與分析

2.1 活性成分和靶點庫的構建

根據GI和DL篩選后，十二味翼首散共納入256個潛在活性化合物，其中翼首草含有8個，榜嘎8個，黑草烏葉3個，麝香21個，角茴香8個，莪大夏21個，五靈脂19個，紅花72個，檀香41個，牛黃9個，安息香46個。經活性成分收集12347個靶點，刪除重復項后，共涉及1066個靶點。十二味翼首散中石灰華經GI和DL指標篩選后無成分納入，故本文暫時未將其納入分析范圍。安息香和紅花的靶點和共有靶點730個，數量最多，提示安息香和紅花在組方中可能發揮著不可或缺的重要作用。黑草烏葉和翼首草預測的靶點和共有靶點數量均較少，提示黑草烏葉和翼首草可能不占主導地位，十二味翼首散藥物潛在靶點詳細見表1。

表1 十二味翼首散藥物潛在靶點分析

2.2 候選靶點通路富集分析

基于STRING數據庫對十二味翼首散候選靶點進行GO注釋結果和KEGG通路富集，其中生物過程獲得3247條富集結果，KEGG通路獲得228條通路。生物過程（BP）主要富集條目為對刺激的反應（response to stimulus）、細胞對刺激的反應（cellular response to stimulus）、蛋白質磷酸化（protein phosphorylation）、代謝過程（metabolic process）等。另外，KEGG通路主要集中在MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、細胞凋亡（Apoptosis）等。根據P排名前20的功能條目進行可視化分析（圖1-圖2）。

圖1 十二味翼首散候選靶點富集的生物過程（top 20）

圖2 十二味翼首散候選靶點富集的KEGG通路（top 20）

2.3 新冠肺炎疾病靶點庫及其PPI網絡的構建

通過GeneCards數據庫收集得到259個新冠肺炎疾病靶點，與十二味翼首散預測靶點取交集，得到重要的81個交集靶點。利用STRING數據庫獲得交集靶點拓撲數據，再使用Cytoscape構建交集靶點PPI網絡，“Analysis”分 析 網絡，得到TNF、IL6、GAPDH、TP53、MAPK3、ALB、EGFR7個核心靶點（圖3）。

圖3 十二味翼首散與新冠肺炎核心靶點網絡

2.4 十二味翼首散與新冠肺炎交集靶點網絡分析

根據Cytoscape中的插件MCODE分析交集靶點網絡分為4大MCODE（子模塊），子模塊代表不同功能互相關聯的蛋白所存在的相互作用而協同完成特定的分子功能[17]。第一大模塊涉及30個節點，377條邊，第二大模塊涉及6個節點，10條邊，第三個模塊涉及4個節點，5條邊，第四個模塊涉及3個節點，3條邊，見圖4。由于十二味翼首散與新冠肺炎的核心靶點均出現在模塊1，模塊2和4未富集到通路，且模塊3的通路與新冠肺炎相關疾病存在較少關聯，故詳細分析模塊1所參與的KEGG通路和GO生物過程功能，其主要涉及3個方面：①參與機體的免疫應答功能和炎癥反應，涉及相關通路為TNF信號通路（TNF signaling pathway）、T細胞活化與免疫應答（T cell activation involved in immune response）、急性炎癥反應的調節（regulation of acute inflammatory response）、白細胞介素-6的反應（response to interleukin-6）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、NFκB信號通路（NF-kappa B signaling pathway）等，②參與血管通透及內皮細胞功能的基本調節通路，主要為VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）、白細胞與血管內皮細胞粘附的調節（regulation of leukocyte adhesion to vascular endothelial cell）、血管內皮生長因子的調節（regulation of vascular endothelial growth factor production）等，③與病毒感染相關功能通路，主要涉及

圖4 十二味翼首散與新冠肺炎交集靶點聚類圖

朊病毒病（Prion diseases）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）（圖5-圖6）。

圖5 十二味翼首散與新冠肺炎交集靶點子模塊1的KEGG通路

圖6 十二味翼首散與新冠肺炎交集靶點子模塊1的GO生物過程

2.5“藥物-活性成分-靶點-通路-功效”關系網絡分析

根據“藥物-活性成分-靶點-通路-功效”關系網絡的構建與分析，涉及11味中藥，即翼首草、榜嘎、角茴香、莪大夏、黑草烏葉、牛黃、麝香、安息香、五靈脂、檀 香、紅 花，luteolin、methyl caffeate、palmitic acid、

myristic acid、pentadecylic acid、hordenine、tanwusine、glycine、glutamic acid等218個活性成分，EGFR、TP53、BCL2L1、RELA、ICAM1、PPARG、STAT1、TNF、CASP3、MAPK3、CXCL8、NOS3、IL6、PTGS2等30個靶點，TNF signaling pathway、T cell activation involved in immune response、regulation of acute inflammatory response、response to interleukin-6、NF-kappa B signaling pathway、MAPK signaling pathway、IL-17 signaling pathway、Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor和regulation of leukocyte adhesion to vascular endothelial cell等20條通路，在輸出的網絡（圖7）中，以不同顏色的節點表示活性成分、靶點以及作用通路，其中：藍色矩形代表藥物，不同顏色的三角形分別代表藥物所對應的活性成分，黃色菱形節點代表作用靶點，而三種顏色的圓形代表作用通路，綠色矩形代表藥物的功效，橙色矩形代表防治“年仍奈”三個階段。

圖7 “藥物-活性成分-靶點-通路-功效”關系網絡

3 討論

自COVID-19發病以來，在新型冠狀病毒疾病發展過程中“細胞因子風暴”常導致急性呼吸窘迫膿毒癥休克及多器官衰竭狀態等加重病情。“免疫-炎癥”貫穿COVID-19發病全過程，從初期的免疫細胞應答，或輕癥向重癥和危重癥轉變，再或者恢復期，均存在著明顯的“免疫-炎癥”網絡失衡[18]。本研究分析藏藥十二味翼首散干預新冠肺炎細胞因子風暴相關的分子生物學基礎，也初步探索了藏藥治療“年仍奈”疾病的新思路。

十二味翼首散來源于《藏醫醫訣補遺》，國藥準字為Z63020053，由翼首草、榜嘎（唐古特烏頭）、角茴香（節裂角茴香）、莪大夏（鐮形棘豆）、黑草烏葉（鐵棒錘）、石灰華、牛黃、麝香、安息香、五靈脂膏（渣馴）、白檀香、紅花組成，方中重用翼首草以發揮清熱解毒，祛風除痹之功效；輔以唐古特烏頭清熱解毒，生肌收斂，節裂角茴香清熱解毒，消炎鎮痛，鐮形棘豆清熱解毒，生肌愈瘡，鐵棒錘祛寒止痛，祛風定驚，渣馴活血散瘀止痛，白檀香清熱消炎，滋補，安息香清熱解毒；佐以清熱解毒之牛黃和消炎止痛之麝香，以加強除瘟消炎之效；石灰華清熱消炎，再配伍清熱，活血，滋補之紅花，可防止因血病而引起的并發癥。其中，翼首草總苷能降低體內IL-1β、TNF-α、IL-17等水平[19]，其抗炎作用可能阻斷炎癥介質的傳遞[20-21]；唐古特烏頭總堿能顯著降低關節炎模型大鼠血清COX-2、IL-1、TNFα等含量[22]；細果角茴香乙醇提取物可能減少肺組織炎癥反應和炎性細胞的浸潤[23]；莪大夏煎液對巨噬細胞的吞噬功能有促進作用，對細胞免疫具有抑制作用[24]；鐵棒錘烏頭堿的抗炎作用與中樞及炎癥灶內前列腺素含量相關[25]；牛黃能降低急性腦出血后炎癥細胞因子TNF-α、IL-6，有效干預炎癥細胞因子的瀑布效應[26]；麝香水溶性蛋白對體液免疫和細胞免疫有增強作用[27-28]；五靈脂抗炎作用可能與抑制前列腺素E（PGE）的合成或釋放有關[29]等等。

根據藏醫學《四部醫典》所記載的“年仍奈”的治療方法，首先是收斂脈竄狹道，其次是結合藥物對治誅滅之，第三是清除痼病，驅逐余跡[1]。根據病程變化，發病初期即熱病初起階段，主要呈現未成型熱的癥狀，表現為全身乏力、惡寒、肌肉和關節酸痛、煩躁、昏睡、譫妄、口苦，脈洪盛等[30]，避免不治未熟熱或“年”，而直接用寒性藥物等，以防止病情惡化，十二味翼首散可能通過黑草烏葉、翼首草、角茴香、牛黃、渣馴等祛風寒、止痛定驚類藥物發揮集熱平穩作用，人體最原始的免疫反應可能是炎癥反應，是免疫反應效應階段的重要組成部分，我們發現十二味翼首散發揮抗炎的核心靶點為TNF和IL6。TNF是流感細胞因子風暴中心的促炎細胞因子，大量TNF-α易刺激白細胞浸潤，可能誘導細胞因子、趨化因子、黏附分子等生成[31-32]，引發過度的炎癥反應亦能加重冠狀病毒的致病性[33]；IL-6作為臨床上公認診斷肺部感染的實驗室指標，是造成細胞因子風暴的典型促炎因子[34]。隨著疾病中期時疫擴展或增盛熱，正邪相爭出現身體沉重，汗臭難聞，舌唇牙齒皆積垢，頭痛，煩躁等癥狀，熱癥催熟后猶如燃料已盡之火，此時削弱瘟熱，正是清熱癥的關鍵時刻[2]，利用網絡藥理學技術結合文獻分析，免疫系統被認為是機體抗病原體感染的重要防線，當病毒或細菌沖破免疫系統的防線，易致病毒或細菌迅速繁殖，加重細胞因子風暴的發生發展[35]。十二味翼首散防治新冠病毒相關感染涉及朊病毒病（Prion diseases）、人 巨 細 胞 病 毒 感 染（Human cytomegalovirus infection）、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）等，中藥抗病毒的途徑分為兩大類：一類是直接抑制病毒，大多為清熱解毒類中藥；另一類是調節機體免疫功能，間接發揮抗病毒或抑制病毒介導的炎癥反應[36]。清熱解毒藥能增強機體抗感染免疫能力，抑制變態反應[37]，翼首草、榜嘎、角茴香、安息香、莪大夏、牛黃、麝香、石灰華、紅花、白檀香等清熱解毒、消炎止痛類藥物發揮散熱驅邪，抑制傳播作用，發揮抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力等藥理作用[38]，涉及CASP3，TNFICAM1，IL6，MAPK1，MAPK14，MAPK3，MAPK8，NFKB1，PTGS2，CXCL8，RELA，STAT1等靶點，參與機體的免疫應答功能和炎癥反應，涉及TNF信號通路（TNF signaling pathway）、急性炎癥反應的調節（regulation of acute inflammatory response）、白 細 胞 介 素-6的 反 應（response to interleukin-6）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、NFκB信 號 通 路（NF-kappa B signaling pathway）等通路。最后溶凝達界呈現空虛狀，表現為身體多汗、頭暈、倦怠、氣短乏力、干嘔，延至全身血管和神經可能出現發熱、譫妄、口干口苦、尿紅而混濁等癥狀，在這個階段要以溫和法治“隆”為主，不能繼續使用寒性藥物等，否則消熱過度，正精耗損，使熱邪復起。新型冠狀病毒刺激全身炎癥因子風暴，炎癥因子啟動凋亡途徑誘導內皮細胞損傷、死亡和脫落，或者使其表達大量黏附分子，介導炎癥細胞黏附和侵入血管壁或血管周圍[39]。最初確診的41例新冠肺炎患者中，重癥監護室治療患者的凝血酶原時間和D-二聚體水平較高[40-41]。十二味翼首散的紅花、安息香、榜嘎、莪大夏、渣馴、牛黃、麝香、白檀香等活血生肌、滋補類藥物發揮安撫身心，調養身體，防治并發癥的防疫作用，本方通過IL6，PTGS2，TGFB1，MAPK1，MAPK14，MAPK3，NOS3，EGFR，FGF2，HMOX1，PPARG，STAT1，TNF等靶點，參與VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）、白細胞與血管內皮細胞粘附的調節（regulation of leukocyte adhesion to vascular endothelial cell）、血管內皮生長因子的調節（regulation of vascular endothelial growth factor production）等血管通透及內皮細胞功能發揮改善血流動力學、抗血栓形成、促血管內皮細胞再生及減輕炎癥反應等作用，直接或間接干預細胞因子風暴，從側面角度反映民族醫藥發揮多靶點、多環節、多通路的網絡調控作用。

少數民族醫藥是我國傳統醫藥和優秀民族文化的重要組成部分[42]，自新冠肺炎疫情爆發以來，少數民族地區結合本民族醫藥理論、傳統經驗知識提取應對突發疫情的方藥和防治措施，成為中醫藥防治疫情、維系公眾健康的重要參與者。本研究基于網絡藥理學方法對藏藥十二味翼首散抗細胞因子風暴潛在機制的探討，發現其通過免疫應答功能和炎癥反應、病毒感染和血管通透及內皮細胞功能調節相關等信號通 路 調 節TNF、IL6、GAPDH、TP53、MAPK3、ALB、EGFR等核心靶點，發揮了集熱平穩、散熱驅邪，抑制傳播、安撫身心，調養身體等重要作用，上述獲取的靶點及通路與文獻報道的細胞因子風暴的發病機制有一定的吻合性，用現代分子生物學語言詮釋藏藥功效原理的科學內涵，為今后開展少數民族醫防治突發“年仍奈”疾病的機制研究提供參考。