MiR-27與miR-29在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及相關(guān)中藥研究應(yīng)用＊

葛 凡，薛 梅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 南京210023）

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病病人最多發(fā)常見的微血管并發(fā)癥。該病病變通常累及全腎，臨床上以持續(xù)蛋白尿、腎小球濾過率（Glomerular Filtration Rate，GFR）進行性下降、高血壓、水腫與貧血為主要發(fā)病特征。全世界范圍內(nèi)，隨著人口老齡化程度加大和糖尿病患病率的持續(xù)增長，DN的發(fā)病率逐年遞增，已成為終末期腎臟病（尿毒癥）的第二誘因，亦是糖尿病患者致死致殘的重要原因。DN的發(fā)病機制一般認為是糖尿病引發(fā)多種代謝紊亂共同作用的結(jié)果，如遺傳易感性、糖代謝紊亂、腎臟血流動力學(xué)的改變、氧化應(yīng)激及激素異常等均起到非常重要的作用[1-2]。西醫(yī)治療以控制血壓、控制血脂、抗炎為主[3]。臨床上，PPAR-γ（過氧化物酶體增殖物激活受體-γ）激動劑、雷公藤多苷、卡托普利和螺內(nèi)酯的組合等[4-5]均可用來治療DN，但效果有限，且存在一定的副作用。

DN在中醫(yī)學(xué)歸屬于“消渴”、“腎消”范疇，它是由于消渴病程日久，遷延引發(fā)水腫、腰痛、尿濁等并發(fā)癥，與稟賦不足、飲食不節(jié)、情志不舒、勞逸過度、失治誤治等導(dǎo)致的臟腑功能失調(diào)有關(guān)，基本病機為“虛、瘀、濁”，脾腎兩虛是其常見的證型[6]。DN由于病情特殊，一般需要較長的治療周期，患者長久服藥治療造成氣虛無力、瘀血阻滯，而瘀血阻滯造成患者腎臟脈絡(luò)不通，進一步造成患者產(chǎn)生蛋白尿，而蛋白尿頑固難消，治標需治本，必須活血化瘀方能見效。因此，在治療上早期應(yīng)注重“扶正”，多用益氣養(yǎng)陰之法，兼顧調(diào)理肝脾腎三臟氣機；病情進展較深，病理產(chǎn)物積聚，則治以“驅(qū)邪”為主[7]。中醫(yī)藥的優(yōu)勢在于“整體論治”和“多靶點干預(yù)”，中藥復(fù)方的療效潤物無聲、平波緩進，且無突出不良反應(yīng)，臨床可長期服用，愈來愈受到廣泛的重視和認可。中醫(yī)辨證論治的治療方法較西醫(yī)治療更為有效，能明顯改善患者的臨床癥狀，總的有效治愈率可達到80%以上（P<0.05）[8]。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性約含有19~24個核苷酸的非編碼小RNA。MiRNA可以減少目的基因的表達，調(diào)控細胞增殖、凋亡和分化的過程[9]。近年來，隨著人們對腎纖維化與miRNA關(guān)系的深入研究發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化各進展期中，miRNAs通過抑制靶基因，調(diào)控巨噬細胞極化、轉(zhuǎn)化生長因子、結(jié)締組織生長因子、血管緊張素II、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)堆積等，抑制纖維化信號通路進而影響腎纖維化。文獻報道，MiR-571、miR-152、miR-1303、miR-192、miR-200、miR-21、miR-146、miR-23、miR-145、miR-126、miR-29、miR-377等多種miRNAs均參與了DN的發(fā)生與發(fā)展過程[10-12]。在前期實驗中，我們用已定量成分的中藥方劑含藥血清干預(yù)高糖培養(yǎng)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞（HK2），細胞樣本高通量miRNAs測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，樣品組20種miRNAs具有顯著差異。通過qPCR進一步驗證與DN相關(guān)的5種miRNAs表達變化發(fā)現(xiàn)，其中，miR-27a-5p表達下調(diào)更為顯著。因此，我們選擇實驗中發(fā)現(xiàn)的miR-27和miR-29兩種表達有顯著差異的miRNA參與調(diào)控糖尿病腎病關(guān)系、下游信號通路及相關(guān)中藥研究應(yīng)用予以綜述。

1 miR-29參與調(diào)控DN的分子機制

MiR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，它們只在2-3個堿基（miR-29a和miR-29b1以及miR-29c和miR-29b2）上有所不同，分別由位于7號染色體或1號染色體上的兩個基因串聯(lián)編碼和轉(zhuǎn)錄。MiR-29已被證明參與抑制細胞外基質(zhì)蛋白的合成，表明具有抗纖維化功能。Targetscan（靶點預(yù)測）預(yù)測程序表明[13]，miR-29家族有可能通過與其3'UTR結(jié)合，抑制多種膠原蛋白（col1a1、col2a1、col3a1、col4a1、col4a3、col4a5、col5a1、col5a2、col6a3等）的合成。同時，有研究結(jié)果表明[13]，miR-29家族異常表達，參與了肝臟、腎臟、心肌、肺等多個組織器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展。可以確定miR-29參與了DN的發(fā)生與發(fā)展，有望成為治療DN的一個重要靶點。

TGF-β/Smads是目前公認促腎纖維化最主要的信號通路，miRNAs通過抑制靶基因，正或負反饋作用于TGF-β/Smads及其他纖維化信號通路，在腎纖維化各進展期發(fā)揮調(diào)控作用。TGF-β1被認為是腎纖維化的關(guān)鍵介體，主要通過激活其下游Smad信號通路引起腎纖維化。

近期，有研究指出[14]，Smad3，而不是Smad2，是響應(yīng)TGF-β1和TGF-β1/Smad3信號纖維化的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑，能夠抑制miR-29表達發(fā)揮作用，促進腎臟纖維化。此外，miR-29也參與了DN腎纖維化的病理過程。在db/db小鼠DN的實驗[15]研究中，miR-29過度表達減弱了腎小球系膜細胞中晚期糖基化末端（AGE）誘導(dǎo)的TGF-β/Smad3介導(dǎo)的纖維化；Western印記、免疫組織化學(xué)和實時PCR也表明，miR-29b治療能抑制db/db小鼠的腎纖維化。同時，Qin等人[16]通過實驗證明了miR-29是TGF-β/Smad3介導(dǎo)的纖維化的下游抑制劑。以上研究均提示，miR-29對腎臟能發(fā)揮一定的保護作用，需更進一步研究miR-29在腎纖維化中的作用，其可能具有進行性腎纖維化的治療潛力。

miR-29已被證明在上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transformation，EMT）中發(fā)揮重要作用，可能有助于EMT的調(diào)節(jié)。研究表明，TGFβ可以通過介導(dǎo)PI3K-AKT信號通路，實現(xiàn)對膠原等細胞外基質(zhì)表達的調(diào)節(jié)；MiR29的過表達可致使PI3K和AKT表達細胞磷酸化水平明顯下降，并抑制其對細胞的遷移和侵襲，從而抑制PI3K-AKT信號通路，減低膠原的表達[17]。此外，Hu等人[18]發(fā)現(xiàn)miR-29b通過PI3K/AKT信號通路在Ang II誘導(dǎo)的EMT負調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因此，提高miR-29水平或阻斷PI3K/AKT信號通路可能是治療腎間質(zhì)纖維化的新靶點。

Wnt/β-catenin信號通路是由配體蛋白Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在介導(dǎo)細胞增殖、分化以及極化過程中具有重要作用[19]，能通過抑制糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）介導(dǎo)的磷酸化作用以及抑制胞質(zhì)中的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）降解等作用來誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)換。研究表明[20]，miR-29的過表達抑制了TGF-β誘導(dǎo)的Wnt3α的表達，從而間接抑制了βcatenin活化的過程。所以，miR-29可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，實現(xiàn)對膠原表達的調(diào)控，減少EMT的積聚。

PTEN（磷酸酶基因）是miR-29的直接靶標，miR-29a通過靶向下調(diào)PTEN促進Akt磷酸化，進而促進TGF-β1誘導(dǎo)的細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力[21]。PTEN能負性調(diào)節(jié)Akt,降低Akt磷酸化水平，而Akt能促進EMT發(fā)生。梁媛等人[22]通過實驗發(fā)現(xiàn)，抑制miR-29a的表達水平可能通過上調(diào)靶基因PTEN，推動Akt磷酸化,抑制EMT的發(fā)生。

2 miR-27參與調(diào)控DN的分子機制

MiR-27家族，包括miR-27a和miR-27b，是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝和心血管疾病生理過程中的新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。值得注意的是，近年來報道I型和II型糖尿病患者血循環(huán)miR-27a水平增高，對行腎活檢的DN患者52例研究發(fā)現(xiàn)患者血漿miR-27a上升，腎功能惡化。體外研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可通過靶向抑制PPAR-γ而誘導(dǎo)NRK（大鼠腎細胞）-52E細胞纖維化，其機制或許與TGF-β1/Smad3通路的激活有關(guān)[23]。因此，研究miR-27如何調(diào)控DN疾病進程，并明確miR-27靶基因及與下游信號通路的關(guān)系，將為尋找或闡明嶄新的治療藥物與方法提供重要的理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)[24]，PPAR-γ是miR-27a的直接下游靶基因，miR-27a通過直接靶向PPAR-γmRNA的3'UTR使其磷酸化，抑制PPAR-γ水平，進而使TGF-β1/Smad3信號通路激活，促進ECM的產(chǎn)生及蓄積。因此，抑制miR-27a的過表達，可能能夠有效減少ECM的積聚。

Wnt3a已被證實為miR-27a-3p的靶基因。MiR-27a-3p可能通過靶向沉默Wnt3a，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位,從而抑制Wnt3a/β-catenin信號通路，減少Col1、Col3合成[25]，間接減少ECM的積聚。

Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導(dǎo)途徑中有四種核心蛋白激酶，Ras、Raf、MEK和ERK。在細胞表面，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的激活通過配體與受體酪氨酸激酶（RTK）的結(jié)合而啟動，然后在細胞核中，四種核心蛋白激酶Ras、Raf、MEK和ERK磷酸化，進而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[26]。MiR-27a-3p可能通過干擾Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制ECM的合成與積聚[27]。

3 中醫(yī)藥干預(yù)下miRNAs參與調(diào)控DN的研究概況

中醫(yī)治療糖尿病腎病的方法很多，中草藥是最主要的形式。以miR-27和miR-29為代表的miRNAs作為參與DN發(fā)生發(fā)展的重要物質(zhì)，在中藥單體、提取物或復(fù)方治療DN的過程中，均能夠通過上調(diào)或下調(diào)自身的表達，從而保護腎臟，達到改善DN的效果。我們總結(jié)了近年中藥單體、提取物、復(fù)方治療DN相關(guān)研究（表1），以期為后續(xù)臨床研究及傳統(tǒng)中藥的應(yīng)用拓展奠定基礎(chǔ)。

表1 中藥單體、中藥提取物、中藥復(fù)方治療DN相關(guān)研究

續(xù)表

4 結(jié)語

DN是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，腎間質(zhì)纖維化是其主要病理變化之一。臨床雖有一些藥物可用，但它們只能暫時緩解癥狀或阻礙一些患者DN的進展。因此，我們迫切需要新的治療策略來控制DN。目前，miRNA已被廣泛用作DN臨床診斷和治療的生物標志物。腎組織、外周血和尿液中miRNA的特異性變化可通過不同的信號通路和靶點，調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝異常、免疫反應(yīng)和纖維化，影響DN的進展，恢復(fù)正常的腎功能。中醫(yī)藥無論是單體、提取物或復(fù)方，都具有多途徑、多靶點的協(xié)同作用。在DN發(fā)生發(fā)展過程中，以miR-27和miR-29為代表的miRNAs，在中醫(yī)藥干預(yù)下，可以通過抑制靶基因，進而調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞外基質(zhì)堆積等，抑制下游信號通路進而影響腎纖維化，達到改善DN的效果。然而，miRNAs與DN的研究和臨床應(yīng)用仍存在許多挑戰(zhàn)，單個miRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的確切調(diào)控和特異功能仍需全面了解，與DN診斷相關(guān)的miRNAs的前瞻性驗證、大樣本量、多中心、多民族患者研究仍然缺乏。為了更好地理解miRNAs在DN中的調(diào)控和功能，仍需要進行大量的研究。MiRNAs干預(yù)治療DN的前景正在顯現(xiàn)，今后，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，通過研究miRNA如何調(diào)控DN疾病進程，并明確miRNA靶基因及與下游信號通路的關(guān)系，將為尋找或闡明嶄新的DN治療藥物與方法提供重要的理論依據(jù)。