基于網絡藥理學的雙黃杞貞克瘤方抗腫瘤機制

郎曉娜，邱玉玲，孔德新

(1.天津醫科大學藥學院，天津 300070；2.天津市天津醫院藥學部，天津 300211)

雙黃杞貞克瘤方包含的黃精、靈芝、黃芪、枸杞子和女貞子5種中藥，均具有顯著地抗腫瘤功效。本研究對該組方進行網絡藥理學分析，研究組方的活性成分和抗腫瘤機制，為今后的實驗研究提供有效且合理的數據。

1 材料與方法

1.1 收集和篩選雙黃杞貞克瘤方中的5種中藥(黃芪、黃精、枸杞子、女貞子、靈芝)的活性成分在中藥系統藥理學數據庫TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中搜索并收集黃芪、黃精、枸杞子、女貞子和靈芝的活性成分及靶點。本文篩選藥物活性成分的依據是口服利用度(OB)≥0.3，類藥性(DL)≥0.18，從而進行篩選。并且找到其相對應的靶點。將其導入Excel表格中進行規范化處理以便于后續研究分析。整理后的靶點使用Uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org)，將靶點的來源物種校正為Human，并整理記錄靶點蛋白的基因信息，用于之后研究的規范性處理。

1.2 收集疾病的相關靶點信息通過Gene Cards數據庫(https://www.genecards.org/)、TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM數據庫(https://www.omim.org/)以“tumour”為關鍵詞檢索腫瘤相關靶點，并將其導入Excel表格中進行規范化處理以便于后續研究分析。

1.3 篩選核心靶點并構建網絡圖將活性成分所對應的靶點基因和腫瘤相關靶點基因進行匹配，通過繪制韋恩圖找到核心靶點(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。采用Cytoscape 3.7.2軟件來構建“藥物-活性成分-靶點”和“核心活性成分-核心靶點”網絡。

“藥物-活性成分-靶點”網絡中的節點表示這5種中藥的活性成分以及活性成分對應的靶點基因。整體網絡是來展示藥物-活性成分與其對應靶點的聯系。為作圖易看并且方便，成分用不同顏色區分，各個活性成分用其名稱的拼音首字母加阿拉伯數字標記，5種中藥共有的成分用大寫字母A、B、C表示。“核心活性成分-核心靶點”網絡中的節點表示與疾病相關的活性成分及其對應靶點基因。通過構建網絡來探討5種中藥抗腫瘤的作用機制。

1.4 構建蛋白質網絡PPIString數據庫(https://string-db.org/，Version11.0)可以用來檢索蛋白質之間的相互作用關系。將“1.3”項中所獲得的核心靶點導入String數據庫，將研究物種設置為人類(Homo sapiens)，將置信度選擇“高置信度”(置信度>0.9),其他參數為默認值，同時刪除網絡中未與其他基因靶點具有互作關系的基因靶點，從而獲得結果可信度較高的重要基因靶點蛋白的互作關系。將網絡數據導入 Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理，繪制蛋白互作網絡圖。設置用網絡中的節點的大小以及顏色深淺來反映Degree值的大小，邊的粗細來反映Combine score的大小。

1.5 對靶點進行GO分析，KEGG通路富集在 Metascape在線平臺(http://metascape.org/)輸入核心靶點，設置P<0.01，進行 GO富集分析[由細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)三部分組成]和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析，按P值升序排列，各選擇前20條分析結果，通過OmicShare網站(https://www.omicshare.com/)分別繪制高級氣泡圖，將結果可視化。

小波變換的閾值去噪過程中,選取合適的閾值和恰當的分解層次是保證良好去噪效果的首要條件。為避免因閾值選取不合理而影響信號去噪,本文在對微流控芯片信號去噪過程中引進能量元的方法,通過能量元放大有用信號和噪聲小波系數之間的差異,在閾值選取時有更大的裕度[11],更容易選取較為合理的閾值。

1.6 繪制“靶點-通路”網絡圖將得到的前20條KEGG富集通路與相關作用靶點整理后導入Cytoscape3.7.2中，繪制“靶點-通路”網絡圖。

2 結果

2.1 活性成分篩選結果通過TCMSP數據庫共檢索到黃芪的化學成分87個，黃精的化學成分38個，枸杞子的化學成分188個，靈芝的化學成分242個，女貞子的化學成分119個。以OB值≥0.3，DL值≥0.18為標準篩選得到各高度活性的化合物，得到黃芪的活性成分20個，黃精的活性成分12個，枸杞子的活性成分45個，靈芝的活性成分61個，女貞子的活性成分13個。合并整理后得到共145個活性成分，其中有3個活性成分重疊出現，結果見Tab 1。由于數量較多，表格只展示部分活性成分。

在TCMSP數據庫繼續用活性成分去檢索其相關靶點，將沒有搜索結果的活性成分刪除，把5種中藥找到的活性成分及對應靶點整理到Excel表格中，將每種中藥的相關靶點合并去重，并用Uniprot數據庫為靶點基因找出對應的基因名，將靶點的來源物種校正為 Human，找不到的靶點視為無效并刪除，將結果規范化，用于以后的分析。得到的結果分別是：黃芪的靶點為200個，黃精的靶點為76個，枸杞子的靶點190個，靈芝的靶點為37個，女貞子的靶點為174個。繪制韋恩圖后可發現5種中藥的靶點都有交集，共同擁有的靶點有22個。體現出這5種中藥之間共同靶點的關系，揭示其協同作用的藥理學特點。5種中藥的靶點合并去重后，通過Uniprot數據庫規范化以后共得到241個靶點。通過Cytoscape3.7.2軟件作“藥物-活性成分-靶點”的蛋白質互作網絡圖。

通過作圖得出：網絡中共319個節點，1 215條邊。319個節點包括78個活性成分和241個靶點。其中每個活性成分平均作用于15.58個靶點，每個靶點鏈接藥物數量為5.04。這代表5種中藥是有共同的成分和靶點作用于疾病。藥物作用是多途徑、多靶點、多環節的，整體以協同方式發揮藥效。

結果顯示，擁有最多靶點的是槲皮素(quercetin)，共有146個；其次是山奈酚(kaempferol)，共有60個；木犀草素(luteolin)，共有55個；7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-Methylisomucronulatol)共42個；β-谷甾醇(β-sitosterol)，共35個靶點。此外，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇這3種化合物重復出現在5種中藥中，表明該成分有關鍵的作用。

2.2 疾病基因篩選結果通過OMIM平臺，TTD數據庫，Gene Cards數據庫對疾病靶點進行搜索，以“tumour”為關鍵詞檢索腫瘤的疾病相關靶點。OMIM平臺搜索到相關基因354個，TTD數據庫搜索到87個，Gene Cards數據庫由于數量過多，按照Relevance Score分數由高到低進行排序，篩選到數值較大的靶點，共搜索到930個，合并三大數據庫的數據之后去重共得到1 285個疾病靶點。

Tab 1 The active compounds in five kinds of traditional Chinese medicine with their OB and DL parameters

2.3 核心靶點篩選及構建網絡圖將藥物靶點和與腫瘤相關的靶點基因進行匹配，并繪制韋恩圖得到核心靶點，見Fig 1。

Fig 1 Matching of target genes between disease and drug

其次，可得知共有113個靶點是5種中藥共同直接作用于腫瘤的核心靶點。再將靶點數據及其相關活性成分導入Cytoscape軟件可構建“核心活性成分-核心靶點”的網絡圖，可發現核心活性成分和核心靶點之間是緊密相連，這些與關鍵靶點有相互作用關系的藥物成分可能是藥物活性成分發揮抗癌作用的重要物質基礎。

通過網絡分析并獲得度值(Degree)排名前10的核心靶點，其中RB1和CCND1度值相同，均被選入。見Tab 2。

Tab 2 Key targets

2.4 構建蛋白質網絡PPI通過將這113個核心靶點導入String數據庫得到蛋白質互作網絡數據，用Cytoscape3.7.2軟件得到這些靶點的關系網，見Fig 2。設置網絡中的節點大小以及顏色深淺反映了Degree值大小，顏色較深、圓圈較大的基因是度值較高的靶點基因，連線較粗、顏色較深表示靶點之間相關性較大。根據度值排名靠前的靶點作為核心靶點，用Cytoscape3.7.2軟件得到更清晰簡易的關系網，見Fig 3。

Fig 2 Protein interaction network of key targets

Fig 3 Protein interaction network of top key targets

2.5 對靶點進行GO分析，KEGG通路富集通過使用Metascape在線平臺(http://metascape.org/)輸入核心靶點，設置P<0.01，進行GO富集分析和KEGG分析，按P值升序排列后，再通過OmicShare平臺對結果進行可視化分析。

2.5.1GO富集分析 在Metascape數據庫以P<0.01對結果進行篩選，對113個核心靶點進行GO功能富集分析。將P值按照升序排列后可以發現：藥物抗腫瘤的作用靶點是涉及大量不同的生物學過程，共有2 236個GO術語條目，其中CC為66個，MF為132個，BP為2 038個，以校正后P為標準升序選取BP前20條作圖，圖左側為富集名稱，氣泡顏色由紅到藍代表 neg.Log10(P)值由小到大，氣泡越大代表該通路的基因計數越多，橫軸代表輸入基因占該通路基因的比率，導入OmicShare平臺處理，見Fig 4-6。

Fig 4 GO-biological process analysis of key targets

Fig 5 GO-cellular component analysis of key targets

2.5.2KEGG分析 這5味中藥對作用于腫瘤的PPI網絡中的核心靶點主要涉及影響腫瘤細胞增殖和凋亡的信號通路如MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路以及TNF信號通路等,前列腺癌和膀胱癌發生和發展相關的通路，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、肺結核信號通路和病毒感染的信號通路等方面。根據氣泡圖可得知這5味中藥對于腫瘤的干預，涉及了多個生物過程，見Fig 7。

2.6 繪制“靶點-通路”網絡圖將雙黃杞貞克瘤方中前20條KEGG富集通路和其對應的核心靶點導入Cytoscape3.7.2，繪制出“靶點-通路”網絡圖，網絡圖可反映出該組方抗腫瘤具有“多靶點、多通路”的調控特點。

Fig 6 GO-molecular function analysis of key targets

Fig 7 KEGG pathway analysis of key targets

3 討論

本研究分析了雙黃杞貞克瘤方的5種成分：黃精、靈芝、黃芪、枸杞子和女貞子，從中得到的145個有效活性成分，通過網絡圖分析預測出5個潛在的活性成分：槲皮素、山奈酚、木犀草素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、β-谷甾醇。槲皮素是廣泛的存在于多種藥物中的多醇羥基黃酮類化合物，有研究表明它能通過誘導凋亡、抑制遷移來抑制宮頸癌細胞的生長[5]。山奈酚是一種黃酮類化合物，報道顯示其可以抑制多種腫瘤細胞周期進程，誘導細胞凋亡，從而抑制腫瘤的遷徙和轉移[6-8]。β-谷甾醇可以有效的抑制結腸癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥細胞的增殖和遷移[9]。這幾種潛在的活性成分在雙黃杞貞克瘤方抗腫瘤活性中發揮重要作用。

通過蛋白質互作網絡圖分析并預測，本研究獲得的與通路密切相關的核心靶點是TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA、IL-6、MAPK8、MAPK14、RB1、CCND1，該結果與之前預測的靶點基本相同。TNF又稱腫瘤壞死因子，參與腫瘤細胞的凋亡過程、影響腫瘤血管系統和增強宿主的免疫力等。AKT1為一種蛋白激酶，參與了乳腺癌、前列腺癌等多種癌癥的發生、發展、轉移和復發的多個環節[10]。AKT1可以作為肺癌的早期診斷標志物，成為抗肺癌新藥研發的靶點之一[11]。TP53是重要的抗癌基因之一，通過在細胞核中的轉錄依賴功能調節基因轉錄，參與細胞周期進程。TP53還可以通過非轉錄依賴功能誘導細胞凋亡和自吞噬[12]。TP53可作為很多腫瘤的檢測指標，比如：淋巴瘤、胃癌、血液病和結腸癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、肺癌等[13]。c-Jun是JUN基因中的一種，研究證明，c-Jun可以作為乳腺癌的預后指標，也參與結直腸癌的發生和發展[14]。MAPK1、MAPK8和MAPK14均為絲裂原活化蛋白激酶，在多種腫瘤組織中呈現高表達，如胃癌、肝癌和胰腺癌等[15]。原癌基因CCND1(細胞周期蛋白D1)的表達異常在乳腺癌、胃癌和膀胱癌等腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中有著重要作用[16]。RB1(視網膜母細胞瘤蛋白1)對視網膜母細胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等都有抑制作用。IL-6是由多種細胞產生的多功能細胞因子，在T淋巴細胞、B淋巴細胞和造血干細胞的增殖，自身免疫性疾病發生、腫瘤細胞生長等方面都有重要作用[17]。RELA能激活癌細胞的增殖或遷移以促使食管癌進展。提示我們，預測出的潛在核心靶點均與抗腫瘤機制有關，都在藥物治療過程中靶向性發揮抗腫瘤作用。

結合GO生物過程分析和KEGG富集分析的結果，得到有關該組方抗腫瘤機制的信息如下：① 結果中顯示有P13K-Akt、MAPK和TNF信號通路以及Apoptosis(細胞凋亡)等。這些通路都是影響腫瘤細胞增殖和凋亡的信號通路。腫瘤是由于基因變異導致的，由于基因轉錄翻譯出現異常、細胞的信號傳遞出現失誤，就可能引起細胞的增殖異常表達，增殖過度和凋亡減少都是腫瘤細胞的基本特征。② 通路的富集結果除了以上腫瘤相關信號通路、前列腺癌和膀胱癌等具體癌癥類型發生與發展相關的通路，也發現了糖尿病、肺結核以及病毒感染相關的信號通路，這可以解釋為這些疾病相關的某些信號通路可能與腫瘤是共通的，同時也提示我們在研究其抗腫瘤作用的同時需要留意可能產生的副作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法分析了雙黃杞貞克瘤方的多成分-多靶點-多途徑抗腫瘤機制。結果顯示，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等主要活性成分作用于TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA、IL-6等靶點，通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，誘導凋亡，影響腫瘤血管系統和增強宿主免疫力等來發揮抗腫瘤作用。