LINC00339通過吸附miR-873-5p上調COMP的表達調控結腸癌細胞增殖、侵襲和凋亡

杜記濤，曹 建，趙 穩，萬相斌，李 智

(鄭州大學附屬腫瘤醫院普外科，河南 鄭州 450003)

結腸癌(colon cancer，CC)是最常見和最具侵襲性的惡性腫瘤之一，占全世界癌癥死亡率第二位[1]。環境和遺傳因素被認為是影響CC發病的主要因素，從治療效果來看，個體差異性比較明顯[2]。

近年來越來越多的長鏈非編碼RNA(long non coding RNA，LncRNA)被發現與惡性腫瘤的各種生物學行為密切相關[3]。LINC00339是一種新近發現的LncRNA，在許多惡性腫瘤中異常表達[4]。例如，研究發現LINC00339在胃癌組織中表達增加，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[5]。但是LINC00339在CC中的作用機制尚未完全明確，這也是本研究重點關注的問題。

研究表明，在腫瘤組織中microRNAs(miRNAs)的表達與腫瘤的侵襲、轉移、預后和耐藥性等有關[6]。miRNAs在CC中的差異表達受到了廣泛的關注。miR-873-5p已被證實在包括CC在內等多種腫瘤中異常表達[7-8]。過表達miR-873-5p可抑制CC細胞的增殖、集落形成和侵襲[9]。軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)，是一種由多種細胞表達的可溶性五聚糖蛋白，以往有研究表明，COMP高表達能夠促進CC細胞增殖、集落形成、抗凋亡能力和腫瘤生長[10]。

本研究借助靶向關系預測網站發現了miR-873-5p和LINC00339和COMP之間的靶向關系，并且設計了一系列實驗探討LINC00339/miR-873-5p/COMP軸在CC發生發展中的作用。希望為對CC的診斷和治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑CC細胞系(RKO、HCT-116、HCT-8、SW620)和人正常腸上皮細胞系HIEC細胞均購自美國ATCC細胞庫；DMEM培養基(90113)、逆轉錄試劑盒(T2240)和細胞裂解液(R010)購自北京索萊寶生物科技有限公司；LipofectamineTM3000試劑盒(L3000015)、熒光原位雜交試劑盒(QVT0519)、CCK-8試劑盒(PA5-32348)和Annexin-V-FITC/PI試劑盒(V13242)購自Thermo Fisher Scientific；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(ab228530)來自Abcam；RNA pull down試劑盒(Bes5102)購自廣州伯信生物科技有限公司；胎牛血清(C0227)、TRIzol試劑盒(R0011)、TBST緩沖液(P0231)、多聚甲醛(P0099)、結晶紫染液(C1021)和ECL液(P0018FS)為碧云天產品。

1.2 儀器顯微鏡(CX43)為OLYMPUS產品；離心機購自德國Sigma公司；熒光定量PCR系統購自美國Roche公司；流式細胞儀(Attune Nxt)購自美國Thermo Fisher。

1.3 生物信息學預測在Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫以“colon cancer”為關鍵詞檢索CC相關的基因表達芯片，選擇GSE136735進行后續分析。篩選差異基因并繪制差異基因表達熱圖，差異基因篩選條件為adj.P.Value<0.05和|LogFoldChange|>1。通過Targetscan(http://targetscan.org/vert_72/)、Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)和miRWALK(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)3個miRNA-mRNA關系在線預測工具對能調控差異基因的miRNA進行預測，并用Venny2.1分析比較。lncRNASNP2數據庫(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)篩選與miRNA存在靶向關系的LncRNA。dbDEMC網站(http://picb.ac.cn/dbDEMC/index.html)預測miR-873-5p在結腸癌中的表達。LncRNA SNP2網站(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP#!/)預測LINC00339在CC中的表達。

1.4 研究對象從我院2018年6月至2020年6月期間的CC手術患者中采集43例CC組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣2-5 cm)。入組患者經病理診斷為CC，術前未接受任何放療或化療。患者均簽署知情同意書，本研究得到本院倫理委員會的批準。

1.5 細胞培養RKO、HCT-116、HCT-8、SW620和HIEC細胞。細胞在含有10%FBS的RPMI 1640培養基中在37 ℃的含5% CO2的細胞培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗，待細胞融合度達到60%-70%后棄上清液，進行后續轉染，穩定轉染24 h后進行相關實驗。

1.6 細胞轉染與分組用lipofectamine 3000試劑轉染miR-873-5p模擬物、抑制劑或其陰性對照。針對LINC00339設計并合成si-RNA及其陰性對照。構建COMP的過表達載體pcDNA3.1-COMP。

分組如下：Blank組(空白對照組)、si-LINC00339組(細胞+ si-LINC00339)、si-NC組(細胞+ LINC00339陰性對照)、miR-NC組(細胞+miR-873-5p陰性對照)、miR-mimic組(細胞+miR-873-5p模擬物)、miR-inhibitor組(細胞+miR-873-5p抑制劑)、si-LINC00339+miR-NC組(細胞+si-LINC00339+miR-NC)、si-LINC00339+miR-inhibitor組(細胞+si-LINC00339+miR-inhibitor)、si-LINC00339+vector組(細胞+si-LINC00339+空白載體)和si-LINC00339+COMP組(細胞+si-LINC00339+pcDNA3.1-COMP)。

1.7 CCK-8細胞以每孔5×103個接種在96孔板中。分別在24、48和72 h添加100 μL CCK-8溶液。在450 nm處用微板閱讀器測量吸光度。

1.8 Transwell法檢測細胞的侵襲能力將細胞與20 μg基質凝膠在4 ℃條件下混合過夜。D2用無血清培養基按1 ∶3的比例稀釋細胞，并加入Transwell室的上室(50 μL/孔)。小室保持平衡孵育30 min后分離細胞，用無血清培養基洗滌并計數，制備成細胞懸液，用無血清培養基沖洗一次，用無血清培養基接種3×108個/L的細胞懸液。將含10%胎牛血清的培養基加入下室，在37 ℃孵育24 h，用PBS洗滌Transwell室，每次5 min，用5%戊二醇固定，0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察。通過基質凝膠的細胞數被用作評估細胞侵襲能力的指標，ImageJ軟件對細胞侵襲數目進行定量。

1.9 流式細胞術取對數生長期的細胞，按1×106個/L以2 mL接種于6孔板內，800 r·min-1離心5 min，收集細胞沉淀，棄上清，用預冷PBS洗滌兩次，加入預冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。吸取100 μL細胞懸液置于新管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后在室溫避光條件下孵育15 min。最后用流式細胞儀進行檢測。

1.10 雙熒光素酶報告實驗將野生型(WT)或突變體(MUT)LINC00339結合miR-873-5p亞克隆到pGL3基本載體中。miR-873-5p與10 μg pLUC-LINC00339-WT或pLUC-LINC00339-MUT共轉染到CC細胞。將野生型(WT)或突變型(MUT)COMP與miR-873-5p結合，亞克隆到pGL3堿基載體中。miR-873-5p與10 μg pLUC-COMP-WT或pLUC-COMP-MUT共轉染48 h后，用雙熒光素酶檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.11 RNA pull-down應用RNA pulldown試劑盒進行RNA免疫沉淀分析。細胞用完全裂解緩沖液裂解。將細胞提取液與抗AGO2或抗IgG抗體偶聯的磁珠孵育6 h，用RT-qPCR分析純化RNA。

1.12 熒光原位雜交將CC細胞置于載玻片上用PBS清洗，用4%甲醛固定30 min。用70%乙醇滲透一晚后，用PBS沖洗兩次。細胞在37 ℃下用LINC00339探針培養過夜。細胞用DAPI染色10 min，用檸檬酸鹽鈉洗滌，并用熒光顯微鏡拍攝。

1.13 qRT-PCR用TRIzol試劑提取組織和細胞中的總RNA，并逆轉錄合成cDNA，操作步驟均依據試劑盒說明書進行。qRT-PCR采用實時熒光定量PCR系統進行。用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。具體操作方法參照文獻進行，以GAPDH作為LINC00339和COMP的內參。以U6作為miR-873-5p的內參，引物序列如下：

Tab 1 RT-PCR primer sequences

2 結果

2.1 生物信息學方法預測CC潛在分子作用機制根據adj.P.Value<0.05和|LogFoldChange|>1篩選差異基因，在GSE136735中找到差異表達基因，繪制了前10個差異基因表達熱圖(Fig 1A)。發現與癌旁組織相比，COMP在CC組織中呈高表達且差異顯著。經查閱發現COMP在CC中已有研究，COMP在CC組織中呈高表達，可促進癌細胞的增殖和侵襲。為進一步探究COMP可能參與的分子作用機制，通過Targetscan、Starbase和miRWALK 3個miRNA-mRNA關系在線預測工具篩選能調控差異基因的miRNA，繪制Venn圖發現交集miRNA為hsa-miR-2355-3p、hsa-miR-676-3p和hsa-miR-873-5p(Fig 1B)。其中在dbDEMC數據庫查閱發現miR-873-5p在結腸腺癌(COAD)中低表達(Fig 1C)，以往研究證實，過表達miR-873-5p可抑制結腸癌細胞的增殖、集落形成和侵襲，因此本研究推測miR-873-5p通過靶向COMP來參與CC細胞生物學行為的調控。

Fig 1 Differentially expressed genes and miRNAs screened from bioinformatics tools

2.2 miR-873-5p靶向結合COMP靶向關系在線預測網站顯示COMP和miR-873-5p存在特異性結合位點(Fig 2A)。雙熒光素酶報告實驗表明，相對于miR-NC和COMP-WT共轉染組，miR-873-5p mimic和COMP-WT共轉染組熒光素酶活性被抑制(Fig 2B)。RNA pull-down進一步證實了二者間的相互作用關系(Fig 2C)。接下來采用qRT-PCR檢測了miR-873-5p和COMP在CC組織和細胞中的相對表達水平，發現miR-873-5p在CC組織和細胞中表達降低，而COMP表達升高(Fig 2D-G)。二者在CC組織中的表達水平呈負相關(Fig 2H)。與對照組相比，miR-873-5p模擬物可降低COMP的表達水平，miR-873-5p抑制劑可提高COMP的表達水平(Fig 2I)。以上結果提示miR-873-5p能夠特異性結合并下調COMP的表達。

2.3 LINC00339競爭性結合miR-873-5p且在CC中高表達為了進一步探究miR-873-5p和COMP在CC中的作用機制，通過RNA22在線預測網站篩選出了可能在上游調控miR-873-5p的LINC00339(Fig 3A)。lncRNASNP2數據庫中顯示LINC00339在CC組織中表達上調(Fig 3B)。熒光原位雜交實驗結果顯示LINC00339在細胞質和細胞核中均有表達(Fig 3C)。雙熒光素酶報告實驗結果顯示相對于miR-NC和LINC00339-WT共轉染組，miR-mimic和LINC00339-WT共轉染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(Fig 3D)。此外，使用生物素化miR-185-5p(bio-miR-185-5p)探針的LINC00339表達水平高于bio-miR-NC探針(Fig 3E)。如Fig 3F-I所示，LINC00339在CC組織和細胞系中較癌旁組織和正常細胞表達升高(均P<0.05)。與miR-873-5p表達呈負相關(r=-0.317 3,P=0.038 1)，與COMP表達正常相關(r=0.352 9,P=0.020 3)。以上結果表明，LINC00339與 miR-873-5p存在靶向關系并且在CC中表達上調。

Fig 2 Validation of miR-873-5p with a targeted relationship with COMP

Fig 3 Validation of LINC00339 with a targeted relationship with miR-873-5p

2.4 敲低LINC00339抑制CC細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡選取LINC00339表達最顯著的RKO細胞進行后續分析。首先通過qRT-PCR檢測LINC00339的敲低效率，如Fig 4A所示，si-LINC00339組LINC00339的表達水平較si-NC組顯著降低，說明LINC00339敲低成功。如Fig 4B所示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細胞活力明顯降低(P<0.01)。如Fig 4C,D所示，Transwell結果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細胞侵襲能力明顯減弱(P<0.01)。流式細胞術分析顯示，敲低LINC00339誘導的細胞凋亡率上升(P<0.01)(Fig 4E,F)。以上結果表明下調LINC00339在CC細胞中的表達可對CC細胞的惡性生物學行為起抑制作用。

2.5 miR-873-5p下調可部分逆轉敲低LINC00339對CC的影響首先檢測了各組細胞中miR-873-5p的表達水平，結果顯示，相對于si-NC組，敲低LINC00339的表達能夠上調miR-873-5p的表達(Tab 2)。如Tab 2、3所示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細胞活力和細胞侵襲能力均顯著降低，細胞凋亡率明顯升高(均P<0.01)。轉染miR-873-5p抑制劑組可部分逆轉si-LINC00339對細胞活力、侵襲和凋亡的影響。結果表明，LINC00339通過調節miR-873-5p的表達對CC細胞的生物學進行調節。

Tab 2 Expression of miR-873-5p and effect of si-LINC00339 or miR-inhibitor on invasion and apoptosis of CC cells n=3)

2.6 COMP上調可部分恢復LINC00339下調對CC細胞增殖、侵襲和凋亡的作用首先檢測了各組細胞中COMP的表達水平，結果顯示敲低LINC00339后，COMP的表達被抑制(P<0.01)(Tab 4)。如Fig 4,Tab 5所示，與si-NC組相比，si-LINC00339組的細胞活力和細胞侵襲能力均降低，細胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)。轉染COMP過表達組可部分逆轉si-LINC00339對細胞活力、侵襲和凋亡的影響。結果表明，LINC00339通過上調COMP的表達促進CC的惡性進展。

Tab 3 Effect of si-LINC00339 or miR-inhibitor on proliferative activity in each group at different time points n=3)

Tab 4 Expression of COMP and effect of si-LINC00339 or COMP overexpression on invasion and apoptosis of CC cells n=3)

Fig 5 LINC00339/miR-873-5p/COMP axis regulates proliferation, invasion and apoptosis of CC cells

Tab 5 Effect of si-LINC00339 or COMP overexpression on proliferative activity in each group at different time points n=3)

3 討論

CC作為常見的消化道腫瘤，目前尚沒有完全行之有效的治療方法，因此，明確其發病機制以及從分子生物學角度探究治療CC的有效靶點十分重要。

有研究報道LINC00339在許多癌癥中異常表達。例如，LINC00339的表達水平在卵巢癌中升高[11]，通過調節miR-148a-3p/ROCK1軸促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。LINC00339通過抑制miR-377-3p而上調DCP1A的表達，從而促進胃癌的進展[12]。本研究發現LINC00339在CC組織和細胞中表達升高，敲低LINC00339能夠抑制CC細胞的增殖和侵襲能力，誘導細胞凋亡。這表明LINC00339在CC進展中可能充當促癌因子。

LncRNA通過調節miRNA來調控蛋白質翻譯，本研究選定miR-873-5p作為研究對象。miR-873-5p是一種具有抑癌作用的miRNA，在宮頸癌[13]、胃癌[14]和膠質瘤[15]等多種腫瘤的進展中均被報道作為抑癌因子發揮作用。且已有研究證明，miR-873-5p在結直腸癌中表達下調，能夠抑制癌細胞的增殖和轉移[16]；此外，miR-873-5p在CC中的作用也得到了初步明確，miR-873-5p過表達能夠抑制CC細胞增殖、侵襲和轉移，促進細胞凋亡[9]。與以往研究一致，我們在CC組織中檢測得到miR-873-5p表達下調。并通過生物信息學網站預測和雙熒光素酶報告實驗及RNA pull-down實驗確定了miR-873-5p和LINC00339的相互作用關系。miR-873-5p與LINC00339在CC中表達呈負相關，LINC00339能夠負調控miR-873-5p在CC組織中的表達水平。si-LINC00339與miR185-5p抑制劑共轉染可逆轉si-LINC00339對細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。這些結果提示LINC00339可能通過調節miR-873-5p促進CC的生長。

COMP是一種細胞外基質蛋白，屬于血栓反應蛋白家族，COMP的活性與CC的發病機制密切相關，已有研究發現COMP在CC中顯著上調，且能促進CC細胞的侵襲[17]。在本研究發現，COMP在CC組織中表達升高，這與以往研究一致。此外，COMP作為miR-873-5p的靶基因能夠被miR-873-5p抑制劑上調表達水平，被miR-873-5p模擬物和si-LINC00339下調表達水平，提示LINC00339能夠通過抑制miR-873-5p調控COMP水平。COMP過表達能夠部分挽救si-LINC00339對CC細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。這些數據表明LINC00339通過競爭性結合miR-873-5p上調COMP的表達進而促進CC的發生發展。

綜上所述，我們的研究初步解釋了LINC00339在CC細胞生物學行為中的調控作用，并且證實了其通過對miR-873-5p/COMP軸進行調控進而影響CC細胞的增殖、侵襲、凋亡(Fig 5)，但本研究也存在一定缺陷，如缺乏動物實驗佐證等。因此，有必要進行進一步的實驗，為今后的研究提供更為深刻的證據。