基于網絡藥理學探討藏紅花治療抑郁癥的作用機制

任 星, 高 蕊，楊 靜,2, 張菀桐, 楊巧寧

(1.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091；2.北京中醫藥大學研究生院，北京 100029)

抑郁癥(depression)是以心境情緒障礙為主的一種臨床癥狀，情緒低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為其主要特征。目前因經濟負擔、工作壓力、情感問題等導致的抑郁患者越來越多，隨著人們對情緒疾病所致危害的認識，許多患者開始接受藥物治療。臨床一線藥物中常用的如舍曲林、氟西汀、帕羅西汀等均屬5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)，此類藥物為臨床抗抑郁首選[1]。其他類型的第二代抗抑郁藥物也多應用于臨床，這些藥物雖療效較為確切，但其花費高、易復發、周期長等問題給抑郁患者帶來一定的困擾。由此，越來越多的患者尋求中醫藥的治療。

抑郁癥屬中醫“郁證”范疇，歷代醫家對其病機闡述各不相同，但不外乎氣郁、陽虛、血瘀等。越來越多活血化瘀類中藥被證實具有抗抑郁的作用，其中藏紅花近年來被國內外學者廣泛深入研究。Vahdati等[2]發現藏紅花能夠改善抑郁癥大鼠海馬中基因的蛋白質表達和轉錄水平，可能通過提高神經肽前體蛋白轉錄水平和活性磷酸化CREB從而發揮抗抑郁作用。同時，也有臨床研究證實藏紅花有關成分對于抑郁癥患者的癥狀具有良好的改善效果,Akhondzadeh等[3]進行了一個隨機、雙盲、對照臨床試驗，比較西紅花柱頭提取物與丙咪嗪的抗抑郁療效。研究結果顯示，兩個治療組均能明顯降低HAM-D評分，且組間無顯著性差異，證實藏紅花相關提取物具有抗抑郁療效。

網絡藥理學是計算機系統生物學時代到來的產物，是一門運用網絡分析技術將藥物成分、靶點、疾病間復雜的網絡關系與中醫藥整體性、系統性相結合，體現中藥多成分、多途徑、多靶點等特點的綜合學科[4]。本研究旨在通過網絡藥理學的方法探討藏紅花抗抑郁機制并進行初步分析，為藏紅花在抑郁癥的臨床應用中提供更準確的科學依據。

1 材料與方法

1.1 獲取藏紅花藥物候選靶點登錄中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP Databases)，檢索并獲取藏紅花已知的化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為條件進一步篩選藏紅花的有效化合物。將獲得的藏紅花有效化合物導入TCMSP 數據庫及Genecards 數據庫中獲取成分作用靶點，并排除重復靶點。運用Uniprot數據庫査詢靶點蛋白對應的基因簡稱，得到藏紅花活性成分調控的疾病靶點。

1.2 獲取藏紅花治療抑郁癥的作用靶點登錄Genecards數據庫獲取疾病靶點，以depression為關鍵詞，人類基因為背景，提取數據庫中信度較高的相關基因靶點(score≥10)。運用Cytoscape軟件中的merge功能將藏紅花藥物成分候選靶點與抑郁癥疾病靶點取交集，獲得藏紅花治療抑郁癥的作用靶點。

1.3 藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網絡構建將上述獲得的藏紅花抗抑郁作用靶點與藏紅花成分重新對接，獲得藏紅花治療抑郁癥的具體活性成分。運用Cytoscape軟件構建藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網絡(C-T network)，并用“Network Analyzer”功能進行網絡可視化拓撲分析。

1.4 GO生物進程及KEGG通路分析將藏紅花藥物成分治療抑郁癥的相關靶點導入Cytoscape軟件的ClueGO分析工具中，進行GO生物學進程及KEGG通路富集分析。

1.5 分子對接驗證選擇C-T network中獲得的degree值較高的關鍵化合物與KEGG富集分析中獲得的相關通路中的關鍵蛋白，運用Autodock vina軟件進行分子對接驗證，預測關鍵蛋白與關鍵化合物小分子的相互作用，并運用Pymol軟件將化學成分與關鍵靶點之間的對接效果進行可視化呈現。

2 結果

2.1 藏紅花藥物化學成分篩選利用TCMSP數據庫，以藏紅花、西紅花、番紅花為檢索詞，以OB≥30%、DL≥0.18為條件篩選得到5個化合物，并參考文獻加入2個藏紅花常用活性成分[5-6]，共得到7個藏紅花的有效活性成分，篩選結果見Tab 1。

Tab 1 List of compounds in traditional Chinese medicine saffron

2.2 藏紅花藥物候選靶點篩選將上述獲得的7個藏紅花活性成分引入TCMSP數據庫及Genecards數據庫，獲得7個活性成分對應107個作用靶點。運用Uniprot數據庫査詢靶點蛋白對應的基因簡稱,最終得到藏紅花調控的疾病靶點103個(4個為非人源靶點)。

2.3 藏紅花治療抑郁癥作用靶點篩選應用Genecards數據庫，以depression為關鍵詞檢索，獲得數據庫中信度較高的相關基因靶點(score≥10)共557個。利用Cytoscape軟件中的merge功能，將上述獲得的103個藏紅花活性成分作用靶點與557個抑郁癥疾病相關靶點取交集，篩選得到25個藏紅花治療抑郁癥的關鍵靶點。

2.4 藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網絡構建將上述篩選得到的藏紅花治療抑郁癥的相關靶點對接回成分，并應用Cytoscape軟件構建藏紅花活性成分-抑郁癥靶點網絡(C-T network)，見Fig 1，并用“Network Analyzer”功能對該網絡進行可視化拓撲分析。網絡包含32個節點，57條邊。其中，7個橘黃色節點代表藏紅花活性成分，形狀越大表示該成分的degree值越高；25個藍色節點代表藏紅花作用于抑郁癥的靶點(基因簡稱)并且形狀越大表示該靶點的degree值越高。在化合物方面，由圖可見degree值較高的化合物分別是quercetin槲皮素(degree=20)、kaempferol山奈酚(degree=11)、Safranal藏紅花醛(degree=7)、crocetin藏紅花酸(degree=7)、isorhamnetin異鼠李素(degree=6)。說明在藏紅花治療抑郁癥的過程中，槲皮素、山奈酚、藏紅花醛、藏紅花酸以及異鼠李素5個活性成分起主要作用。

Fig 1 C-T Network

2.5 GO生物進程及KEGG通路分析將藏紅花作用于抑郁癥的25個基因靶點導入Cytoscape軟件的ClueGO分析工具中進行GO生物進程及KEGG通路富集分析，得到藏紅花治療抑郁癥的生物進程及KEGG通路結果。

2.5.1生物進程聚類分析結果 通過GO生物進程分析，如Fig 2，可得知藏紅花治療抑郁癥可能主要是通過參與影響以下體內生物進程相關：① 神經遞質代謝過程;② 過氧化氫的生物合成過程；③活性氧生物合成過程等。由此可知，藏紅花抗抑郁主要體現在調節神經遞質的代謝過程和氧化應激等方面。

2.5.2KEGG聚類分析結果 為進一步探究藏紅花治療抑郁癥的具體機制，應用ClueGo分析工具對藏紅花抗抑郁的相關靶點進行通路分析，結果如Fig 3所示。由圖可知，藏紅花抗抑郁的相關通路包括IL-17信號通路、HIF-1信號通路及TOLL樣受體信號通路等炎癥通路以及PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路、松弛素信號通路、Th17細胞分化等通路。經進一步文獻檢索[7]，藏紅花治療抑郁癥的重要通路可能是PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路，本研究對這兩條通路進行分析，具體見Fig 4,5。圖中通路靶點標記為綠色，藏紅花治療抑郁癥的靶點標記為粉色。在PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中，提示藏紅花抗抑郁通過調節其中幾個環節起作用，主要靶點為BDNF、GSK3B、NOS3、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN等。

Fig 2 GO cluster analysis results

2.6 分子對接驗證由KEGG聚類分析結果得知，在PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中，藏紅花抗抑郁主要靶點為BDNF、GSK3B、NOS3、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN。經進一步文獻查閱，腦源性神經營養因子(BDNF)是影響海馬結構和功能改變的關鍵因子，許多藥物均通過BDNF從而發揮抗抑郁作用[8]。在配體方面，由于異鼠李素、山奈酚、槲皮素是很多中藥的化學成分，不具有代表性，因此選擇2個藏紅花中具有代表性的關鍵化合物藏紅花酸和藏紅花醛與PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中共有的靶點蛋白BDNF進行分子對接驗證。通過PDB數據庫獲得BDNF靶點的晶體結構文件，TCMSP數據庫獲得關鍵化合物藏紅花酸和藏紅花醛的mol2格式文件。運用Autodock vina分子對接軟件上傳靶點蛋白以及藏紅花酸、藏紅花醛的結構文件進行分子對接并用Pymol軟件將分子對接模擬驗證結果進行可視化。2種化學成分與靶蛋白均可對接成功，見Fig 6,7。故預測藏紅花中藏紅花醛和藏紅花酸在抗抑郁作用機制PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路中發揮關鍵作用。

3 討論

藏紅花具有化瘀解毒、涼血活血和解郁安神的功效?！讹嬌耪份d其“主心憂郁結，氣悶不散，久服令人心喜”。近年來，相關研究表明，藏紅花在改善精神疾病包括抗抑郁，焦慮以及改善認知障礙和睡眠障礙等方面有一定進展。但很少有實驗涉及到藏紅花在抗抑郁過程中產生的作用機制。

本研究運用網絡藥理學及分子對接手段，通過分析藏紅花與抑郁癥分子網絡在生物功能方面的異同，初步探索藏紅花抗抑郁的作用機制。研究發現在藏紅花治療抑郁癥的過程中，作用較強的化合物是槲皮素、山奈酚、藏紅花醛、藏紅花酸和異鼠李素。藏紅花醛和藏紅花酸作為藏紅花中特有的成分，近年來的相關藥理研究表明，它們都具有神經保護作用。Tashakori-Sabzevar等[9]的研究顯示，藏紅花酸對慢性腦低灌注大鼠的大腦皮質及海馬區域神經元具有保護作用，并可有效防止因慢性腦灌注不足導致的神經病理改變，改善大鼠空間學習記憶能力。Sadeghnia等[10]證明藏紅花醛可抑制自由基的產生和增加抗氧化活性，通過降低脂質過氧化水平，對抗氧化應激損傷保護大鼠海馬，并預防海馬硫醇氧化還原和抗氧化狀態的減弱。

Fig 3 KEGG pathway cluster analysis results

Fig 4 PI3K-Akt signaling pathway

Fig 5 MAPK signaling pathway

Fig 6 BDNF-Safranal molecular docking

Fig 7 BDNF-crocetin molecular docking

通過GO生物進程聚類分析和KEGG通路聚類分析，可得知藏紅花抗抑郁可能主要通過參與調節神經遞質的代謝過程和氧化應激等生物進程。神經遞質穩態調節機制的損傷是目前廣泛研究的一類抑郁癥發病機制。5-羥色胺(5-HT)作為一種單胺類神經遞質參與多種腦內生理功能及病理狀態，有研究表明抑郁、焦慮癥模型大鼠腦組織中5-HT明顯低于正常大鼠[11]。抑郁癥與氧化應激損傷關系密切[12]，是一種慢性的心理及生理應激過程，在此過程中體內神經內分泌系統的功能隨之變化，進而引起氧化應激系統的激活，導致中樞神經系統的氧化損傷，并可能進一步誘發抑郁癥的發生發展[13]。在信號通路的調控方面，藏紅花治療抑郁癥可能主要調控IL-17信號通路、HIF-1信號通路及TOLL樣受體信號通路等炎癥通路以及PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路、松弛素信號通路、Th17細胞分化等通路。本研究重點對PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路進行分析，發現藏紅花可通過BDNF、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN、GSK3B、NOS3等靶點參與治療抑郁癥，主要體現在神經營養因子的調節、抗炎、抗氧化應激等方面。MAPK 信號通路存在于人體大多數細胞內，具有廣泛的生理作用。而MAPK信號通路之一的ERK1/2通路能夠介導神經營養因子、生長因子發揮抗抑郁作用[14]。PI3K-Akt 信號通路與抑郁癥的發生發展密切相關，中樞神經元和海馬干細胞的功能可因PI3K-Akt 信號通路受抑制而下降，相反，提高PI3K-Akt信號通路的表達，能夠有效降低海馬神經元凋亡并促進其再生，增加海馬神經突觸可塑性，緩解抑郁，減少精神類疾病的產生[15]。腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養因子家族中的重要成員，是腦內5-HT、多巴胺(DA)能神經元的生長因子，促進5-HT、DA等神經遞質的合成[16]。NO是重要的神經遞質和炎癥介質，可以通過NOS/NO系統調節多種神經遞質釋放[17]。相關證據表明，情緒障礙與炎癥系統的激活和免疫系統的改變密切相關。抑郁癥患者血液中含有大量的炎性因子，可以引起抑郁不同的臨床表現。相關單核細胞研究發現，GSK3可以通過激活不同種類的Toll樣受體誘發炎癥反應，也可促進前炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNF-α的產生[18]。

綜上所述，藏紅花治療抑郁癥的作用機制主要通過調節神經營養因子促進五羥色胺及多巴胺等神經遞質的合成；抑制炎癥因子釋放減緩炎癥反應，改善抑郁狀態；調節體內氧化應激反應，保護中樞神經系統，減緩抑郁癥發生發展的進程。本研究從網絡藥理學的角度闡述了藏紅花治療抑郁癥的作用機制，為藏紅花治療抑郁癥并進一步提高臨床療效提供了有效證據。