獸藥殘留檢測方法驗證探究

任展 夏夢雯

摘 要 實驗室引入新標(biāo)準(zhǔn)方法開展獸藥殘留檢測時，應(yīng)在實驗室內(nèi)對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行驗證。因此，根據(jù)農(nóng)業(yè)部2386號公告、NY/T 1896-2010、GB/T 27417-2017、GB/T 35655-2017介紹了如何對獸藥殘留色譜定量分析方法進(jìn)行驗證，以期為縣級農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測實驗室開展獸藥殘留檢測工作提供參考。

關(guān)鍵詞 獸藥殘留檢測;標(biāo)準(zhǔn)方法;方法驗證;色譜定量分析

中圖分類號：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.18.089

方法驗證是實驗室建立可靠分析系統(tǒng)的基礎(chǔ)，是實驗室證明其具備技術(shù)能力運用新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，是實驗室證明其所得檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性的一種手段。實驗室在初次使用標(biāo)準(zhǔn)方法前、在標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)生變化時，應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行驗證，并提供相關(guān)證明材料。因此，基于農(nóng)業(yè)部2386號公告和NY/T 1896-2010中方法驗證的要求，在進(jìn)行方法驗證時應(yīng)對方法性能指標(biāo)選擇性、檢出限、定量限、線性范圍、正確度、精密度和穩(wěn)健性進(jìn)行驗證。

1 方法性能參數(shù)的驗證及其質(zhì)量控制要求

1.1 選擇性

標(biāo)準(zhǔn)方法已經(jīng)采取了必要的手段排除了重大干擾物質(zhì)對分析方法的影響，但對于應(yīng)用方法的實驗室驗證，應(yīng)依據(jù)檢測方法的程序檢查因試劑耗材、器皿、基質(zhì)等因素所導(dǎo)致的干擾情況。

1）試劑空白。對試驗中所用到的試劑，按照檢測方法的要求進(jìn)行測試，觀察色譜圖中的出峰，以檢查在整個試驗過程中所用的試劑、器皿及其他試驗用品是否對目標(biāo)組分的分析存在干擾;

2）使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制一定濃度的單一目標(biāo)組分標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和多目標(biāo)組分的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機確定各目標(biāo)組分保留時間、分離度、峰形及峰面積。該測試數(shù)據(jù)及圖譜可以為目標(biāo)組分的識別和含量計算、考察配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液有效期提供初始比對依據(jù);

3）根據(jù)類別分析不同基質(zhì)的空白樣品，檢查在目標(biāo)物出現(xiàn)的區(qū)域是否存在干擾;

4）在有代表性空白樣品中添加一定濃度目標(biāo)組分進(jìn)行檢測，檢查目標(biāo)組分在圖譜中的出峰區(qū)域是否有干擾。

1.2 檢出限

對于有允許限量規(guī)定的目標(biāo)分析物，獨立檢測檢出限濃度水平下制備的10個標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，目標(biāo)組分檢出概率應(yīng)達(dá)到50%;對于規(guī)定為不得檢出的目標(biāo)分析物，在此濃度水平下獨立檢測20個加標(biāo)樣品，檢出概率應(yīng)達(dá)到95%。

1.3 定量限

在標(biāo)準(zhǔn)所限定的檢測范圍，制備定量限濃度水平下的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，依據(jù)檢測方法進(jìn)行試驗，依據(jù)農(nóng)業(yè)部2386號公告或NY/T 1896-2010對檢測結(jié)果的正確度和精密度進(jìn)行評價，以此判斷實驗室檢測能力能否達(dá)到方法的定量限。

1）使用空白樣品制備7個定量限濃度水平下標(biāo)準(zhǔn)添加樣品;

2）檢測上述樣品，得到相應(yīng)的響應(yīng)信號（如峰面積、峰高等），并計算出樣品前處理后目標(biāo)組分的濃度（或量），根據(jù)添加量計算出該濃度水平的添加回收率及平行樣品間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差;

3）得到的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)滿足規(guī)范中相應(yīng)的濃度水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差要求。

1.4 線性范圍

校準(zhǔn)曲線（一般為線性曲線）至少做5個濃度點（不包含空白濃度點），濃度范圍盡可能覆蓋2個數(shù)量級，每個濃度點重復(fù)配制2～3個，定量限、最大殘留限量或10倍定量限及被測樣品中目標(biāo)組分濃度應(yīng)在校準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，曲線相關(guān)系數(shù)不低于0.997。列出校準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)，并附上機檢測的色譜圖。

1.5 正確度

一般采用測定添加回收率的方法對農(nóng)、獸藥藥物殘留的正確度進(jìn)行評價。添加回收試驗一般做3個濃度水平，每個水平重復(fù)檢測不少于3次，并計算同一水平下檢測結(jié)果平均值及添加回收率[1]。

1）對于禁用藥物，在方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限進(jìn)行3水平添加回收試驗;

2）對于已制定最大殘留限量的藥物，在1/2最大殘留限量、最大殘留限量、2倍最大殘留限量3個水平點進(jìn)行試驗，如果最大殘留限量值是定量限，可參考禁用藥物進(jìn)行試驗;

3）對于未制定最大殘留限量的，可在方法定量限、常見限量指標(biāo)和某一適當(dāng)點進(jìn)行3水平試驗。

1.6 精密度

在重復(fù)性的測試中自由度至少應(yīng)為6。即對一個樣品至少平行測定7次;對2個樣品每個樣品至少平行測定4次;對3個樣品每個樣品至少平行測定3次。

重復(fù)性的試驗可采用在空白樣品中添加一定濃度的目標(biāo)分析物，然后在較短的時間內(nèi)由同一個檢測人員進(jìn)行測定，并計算結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（即變異系數(shù)）。

1.7 穩(wěn)健度

穩(wěn)健度主要是指可通過由實驗室人員預(yù)先設(shè)計好的微小的合理變化因素，并綜合分析它們的直接影響。對穩(wěn)健度考察的分析方法來源于《化學(xué)分析實驗室協(xié)同試驗設(shè)計及統(tǒng)計分析手冊》，采用7因素2水平的正交試驗對穩(wěn)健度進(jìn)行驗證[2]。

1）查找在樣品預(yù)處理、提取、凈化、分析等過程中可能影響檢測結(jié)果的因素。可以包括不同來源試劑耗材、不同樣品、不同溫度、不同pH值及其他可能出現(xiàn)的因素。對變量進(jìn)行考察時，同一因素不同水平的值推薦為方法規(guī)定值的±10%，如稱樣量為5.00 g，其穩(wěn)健度考察水平為4.50 g和5.50 g;消解時硝酸的加入量為10 mL，其穩(wěn)健度考察水平為9 mL和11 mL[3]。

2）實驗室應(yīng)仔細(xì)分析影響因素，從中選擇7個重要因素作為考察對象。如果所要考察的因素數(shù)量多于7個，可設(shè)計多個試驗方案;相反考察的因素不到7個，例如只考察6個因素，則最后一個因素可以設(shè)為常量而不需要進(jìn)行考察，但列為常量的因素也應(yīng)納入計算和統(tǒng)計。7因素2水平正交試驗表見表1。

3）將各大寫的因素和小寫的因素分為2組，由此計算各個因素變化對結(jié)果的影響量。如因素從G到g變化的影響量可由編號1、4、6、7號試驗結(jié)果的平均值和編號2、3、5、8試驗結(jié)果的平均值之間的差值得出。當(dāng)2組計算公式相減求G到g因素變化對結(jié)果影響量時，大寫因素A到F和小寫因素a到f均在2組平均值公式中出現(xiàn)了2次，2平均值相減后，A/a到F/f因素變化對結(jié)果的影響均被抵消，按此方式可求得A/a到G/g到各因素變化對結(jié)果的影響量[4]。

d1=A-a=（I+II+III+IV）/4-（V+VI+VII+VIII）/4

d2=B-b=（I+II+V+VI）/4-（III+IV+VII+VIII）/4

d3=C-c=（I+II+VII+VIII）/4-（III+IV+V+VI）/4

d4=D-d=（I+III+V+VII）/4-（II+IV+VI+VIII）/4

d5=E-e=（I+III+VI+VIII）/4-（II+IV+V+VII）/4

d6=F-f=（I+IV+V+VIII）/4-（II+III+VI+VII）/4

d7=G-g=（I+IV+VI+VII）/4-（II+III+V+VIII）/4

4）計算該穩(wěn)健性試驗條件下8次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，將其與上述7個影響量進(jìn)行比較，如果影響量大于2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，則該因素的影響是顯著的。在總結(jié)驗證結(jié)果時，應(yīng)特別指出，并要求檢測人員小心地控制，必要時編制作業(yè)指導(dǎo)書。

2 結(jié)語

實驗室基于對影響因素的有效控制為前提，以節(jié)約人力、物力、財力、提高工作效率和易于操作為原則對方法性能指標(biāo)進(jìn)行驗證。筆者只對方法性能指標(biāo)的驗證方式進(jìn)行了論述，實驗室還應(yīng)依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范要求對人員、儀器設(shè)備、環(huán)境等因素進(jìn)行考察，以證明實驗室具備相應(yīng)的能力運用該方法[5]。

1）選擇性。色譜檢測結(jié)果的定性是基于目標(biāo)物的保留值，但僅根據(jù)保留值對一個完全未知的樣品定性是不可靠的。在人員、試劑耗材、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、儀器設(shè)備和環(huán)境條件一定的條件下，在分析中應(yīng)盡量選擇不同種類有代表性的樣品進(jìn)行驗證，以確定樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾情況。為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確，出現(xiàn)陽性結(jié)果時，實驗室應(yīng)對檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢[6]。

2）檢出限和定量限。在實際檢測工作中，檢測結(jié)果在方法檢出限以下時，報告為“未檢出”，并標(biāo)注出目標(biāo)物的方法檢出限;檢測結(jié)果在方法定量限以上時，報告檢測結(jié)果;檢測結(jié)果在檢出限以上，定量限以下時，檢測結(jié)果報告為“定性檢出”[7]。

3）線性范圍。由于色譜檢測器穩(wěn)定性的問題，其響應(yīng)值隨時間在變化，在實驗檢測工作中如采用標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，每條曲線使用的時間往往比較短，反復(fù)校正曲線工作量比較大;在實際檢測工作中通常使用單點粗篩，對陽性或超標(biāo)樣品，配相近的濃度點標(biāo)準(zhǔn)溶液或基質(zhì)標(biāo)液進(jìn)行校正[8]。

4）正確度和精密度。精密度的驗證可與正確度的驗證同步進(jìn)行，試驗的濃度水平依據(jù)正確度的驗證要求進(jìn)行選取，試驗的結(jié)果應(yīng)達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的要求。

5）穩(wěn)健性。建議采用關(guān)注濃度水平下的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品作為穩(wěn)健性考察的樣品。如果將稱樣量作為一個考察因素，加標(biāo)時應(yīng)確保每一份試樣中加入的目標(biāo)分析物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是一致的，以免人為的放大稱樣量對結(jié)果的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[2] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.化學(xué)分析方法驗證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制實施指南 色譜分析：GB/T 35655—2017[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[3] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.實驗室質(zhì)量控制規(guī)范，食品理化檢測：GB/T 27404—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[4] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.化學(xué)分析方法驗證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求：GB/T 32465—2015[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5] 農(nóng)業(yè)部.農(nóng)藥殘留檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2386號公告）[EB/OL].（2016-04-11）[2021-05-20].http：//law.foodmate.net/show-188438.html.

[6] 農(nóng)業(yè)部.獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范：NY/T 1896-2010[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[7] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.出口食品、化妝品理化測定方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定：SN/T 0001-2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[8] 鄭衛(wèi)東.化學(xué)分析實驗室協(xié)同試驗設(shè)計及統(tǒng)計分析手冊[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2014：44-47.

（責(zé)任編輯：劉寧寧）