酶聯(lián)免疫檢測在冰葡萄組培苗上的應(yīng)用

王丹萍 曲 淼 楊殿靜 趙殿輝 王洪偉

（通化市園藝研究所 吉林通化 134000）

葡萄是果樹中感染病毒病最多的樹種之一，種類多，分布廣，危害大。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的葡萄病毒病20個(gè)屬55種，我國鑒定明確的葡萄病毒總共有6種。北冰紅冰葡萄發(fā)現(xiàn)有四種主要病毒，葡萄卷葉病毒（GLRaV）、葡萄花葉?。℅CMV）、葡萄扇葉病毒（GFLV）、葡萄栓皮病毒（GCBD）。本試驗(yàn)通過酶聯(lián)免疫檢測手段篩選無病毒種苗，進(jìn)而達(dá)到擴(kuò)繁和工廠化生產(chǎn)北冰紅脫毒苗的目的。

1 試驗(yàn)流程

通過人工觀察篩選無病毒病表現(xiàn)優(yōu)良單株（田間鑒定），扦插繁育少量種苗，取莖尖進(jìn)行無病毒植株接種，將組培苗置入培養(yǎng)箱38℃高溫脫毒培養(yǎng)，后進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定試劑檢測病毒。

血清學(xué)檢測葡萄病毒是目前檢測植物病毒的重要技術(shù)之一。本試驗(yàn)利用美國NanD.LLC公司針對葡萄四種病毒的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑，采用三抗體夾心法，堿性磷酸酶結(jié)合進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附（ELTSA）測定。

1.1 試驗(yàn)材料

包被抗體、AP共軛A瓶、AP共軛B瓶、葡萄扇葉病毒（GFLV）正對照、葡萄扇葉病毒（GFLV）負(fù)對照、葡萄栓皮病毒（GCBD）正對照、葡萄栓皮病毒（GCBD）負(fù)對照、葡萄花葉病毒（GCMV）正對照、葡萄花葉病毒（GCMV）負(fù)對照、葡萄卷葉病毒（GLRaV）正對照、葡萄卷葉病毒（GLRaV）負(fù)對照、納米診斷的ELISA測試的凍干對照、PNP底片、PNP板、測試板、培養(yǎng)皿、平底板、移液器、試管、冰箱、培養(yǎng)箱

1.2 制備所有緩沖液

緩沖液配方：①包被緩沖液：碳酸鈉1.60g、碳酸氫鈉2.92g、疊氮化鈉0.2g溶于蒸餾水，定容至1000毫升，pH值調(diào)至9.6，4℃貯藏。②PBST緩沖液：二堿基磷酸鈉1.15g、磷酸鉀0.2g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.2g、吐溫-20 0.5g溶于蒸餾水，定容至1000毫升，調(diào)節(jié)pH值至7.3。③SB1緩沖液：卵清蛋白粉2.0g、聚乙烯吡咯烷酮10.0g、亞硫酸鈉1.3g、疊氮化鈉0.2g、吐溫-20 10.0g溶解在1000毫升1×PBST中。調(diào)節(jié)pH值至7.3，4℃貯藏。④ECB1緩沖液：牛血清白蛋白2.0g、聚乙烯吡咯烷酮10.0g、疊氮化鈉0.2g在1000毫升1×PBXT中溶解。調(diào)節(jié)pH值至7.3，4℃貯藏。⑤PNP緩沖液：二乙醇胺97.0ml、氯化鎂0.1g、疊氮化鈉0.2g溶于800ml蒸餾水，pH值9.8，儲(chǔ)存于4℃。

1.3 測試步驟

將濃縮的包被抗體按1∶200稀釋到包被緩存液中。在玻璃容器中制備包被抗體。吸取100μ的包被抗體放入每個(gè)孔中。將包被板放潮濕的培養(yǎng)箱中放在（4℃）冰箱中一夜進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)結(jié)束后，用PBST注滿微孔來清洗包被板，重復(fù)6次。

選擇9瓶不同植株培養(yǎng)的試管苗底部葉片組織用于酶聯(lián)免疫吸附測試。清洗后，提取植物莖葉汁液，將汁液以1∶10（汁液量∶緩沖液量）的比例稀釋到SB1樣品提取緩沖液中。每微孔加100μl供測樣本。

將100μl正對照和注入正對照微孔，將100μl負(fù)對照注入負(fù)對照微孔中。將被板放入潮濕箱中，在室溫（21～24℃）下培養(yǎng)2.5小時(shí)。培養(yǎng)完成后，向微孔內(nèi)注入PBST來清洗被板，重復(fù)6～8次。

所有的測試微孔中，每個(gè)微孔分配100μl共軛酶（加入10μlA瓶液體和10μlB瓶液體至ECB1緩沖液）。在室溫（21～24℃）下，將被板放入潮濕的培養(yǎng)箱中培育2.5小時(shí)。

每孔分配100μl PNP底物溶液（濃度為1mg/ml）。室溫（21～24℃）下，在潮濕的培養(yǎng)箱中對板培養(yǎng)60分鐘。取出后每孔加入50μl 3M氫氧化鈉中止反應(yīng)。加入120μl納米診斷的ELISA測試的對照液。

2 試驗(yàn)結(jié)果

測試結(jié)果可以用肉眼檢查。測試孔中的顏色為黃色則表明陽性結(jié)果。微孔中沒有顯著顏色變化進(jìn)展表明陰性結(jié)果。只有陽性對照孔呈現(xiàn)出陽性結(jié)果，陰性對照孔依然無變化，測試結(jié)果有效。

通過以上試驗(yàn)方法，分別對葡萄卷葉病毒（GLRaV）、葡萄花葉病（GCMV）、葡萄扇葉病毒（GFLV）、葡萄栓皮病毒（GCBD）進(jìn)行了測試，結(jié)果均顯示樣本中未檢測出相應(yīng)病毒。

3 結(jié)論

使用酶聯(lián)免疫檢測的方法對隨機(jī)抽樣的樣品進(jìn)行測試表明，通過熱處理和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法能夠有效的抑制病毒，多次脫毒后可獲得無病毒株，進(jìn)而研究無細(xì)胞分裂素繁殖技術(shù)，脫毒苗是目前防治北冰紅冰葡萄病毒病唯一技術(shù)手段，研發(fā)“北冰紅”冰葡萄工廠化脫毒苗生產(chǎn)技術(shù)，提供優(yōu)良種苗，提供綠色栽培技術(shù)，保證北冰紅種植健康發(fā)展。