不同煙草品種幼苗對干旱脅迫的生物學響應

洪以群，胡海軍，吳亞男，景檸檬，王 麗,申 林

(遵義師范學院，貴州 遵義 563006)

1 引言

煙草(NicotianatabacumL.)，茄科煙草屬植物，是中國重要的經濟作物之一。貴州省是我國煙草生產的第二大基地，其年產量約占全國比重的12%～15%[1]。干旱是由于長期無雨或少雨，使得土壤相對含水量降低，作物水分平衡遭到破壞而減產的農業氣象災害。干旱是我國農業生產面臨的嚴重問題之一。近年來，大面積周期性降雨量分布嚴重失衡，以及用水不當等均使干旱的程度進一步加劇。干旱條件下，導致農業損失超過其它逆境所造成損失的總和[2]。

干旱脅迫是指當植物根系的吸水量小于植物體內生理代謝活動的耗水量時，植物細胞出現水分虧缺，細胞發生質壁分離，使得植株的生長發育和生理代謝受到影響的現象。干旱脅迫對植物的危害主要體現在：細胞活性、器官和組織功能受損，植物體活性氧增加，細胞滲透調節物質發生變化，最終使得植物個體或植物群體的生長受到抑制，形態發生變化，生物量和產量都受到了極其嚴重的負面影響[3]。陳貴等[4]研究表明，丙二醛是煙草受到干旱脅迫時發生過氧化反應的最終產物之一，對于煙草葉片具有較大的細胞毒性，能夠引起煙草植株細胞功能上的紊亂，并且會對細胞中的核酸、蛋白質、酶等造成一定程度的破壞；丙二醛含量高低能夠反映出煙草幼苗受到干旱脅迫時細胞質膜受破壞程度的大小，煙草細胞膜脂發生過氧化作用的強弱。朱鳳榮等[5]研究認為，丙二醛較高的煙草品種，其抗旱性相對較弱。羅占春等[6]研究結果表明，在干旱脅迫的條件下，煙草植株體內的活性氧物質不斷升高，且不同品種煙草植株間的變化趨勢相似，但不同品種煙草幼苗體內的活性氧物質的變化幅度有所不同。在干旱脅迫的條件下，煙草在抵御氧化脅迫的整個防御系統中，超氧化物歧化酶是煙草體內第一個清除活性氧的關鍵酶。覃鵬等[7]研究結果表明，超氧化物歧化酶相對活性越高，干旱脅迫對煙草完成正常生理活動的影響越小，該煙草的抗旱性越好。過氧化氫酶主要存在于植物微體中，與過氧化物酶同是H2O2的解毒劑，能夠有效控制植物細胞內活性氧的積累[8]。此外，過氧化氫酶還與生長素、NADH、DADPH等的氧化作用有關，在植物的代謝過程中起著非常重要的作用，其活性的高低與植物的代謝強度以及抗性有著極其密切的關系。由佳輝等[9]研究結果表明，相對電導率是用來衡量植物抗逆性的一個重要指標；相對電導率越高，細胞膜的透性越差，干旱脅迫對煙草細胞膜的傷害越嚴重，即植物受到的傷害程度越大，其抗旱性能越差。楊偉強等[10～12]研究認為，不同煙草品種幼苗在同等干旱脅迫的環境中，可溶性糖含量越高，細胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，抗性越高。綜上所述，在干旱脅迫的條件下，不同煙草品種對干旱脅迫的生物學響應各有不同，但可在一定程度上反映出不同品種的抗逆性。

本試驗以亞布力旱煙和云煙87為試驗材料，通過對其丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、相對電導率、過氧化氫酶活性、可溶性糖含量等生理指標進行測定，進一步明確不同煙草品種幼苗對干旱脅迫的生物學響應，以減輕貴州地區因干旱脅迫造成煙草產量和品質的降低，充分發揮該地區煙草種植的生產潛力，實現干旱脅迫下農業可持續發展以及大力保障煙草作物經濟安全，為篩選抗旱性能較強的品種提供參考依據。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

烤煙品種：云煙87，由云南省煙草科學研究所提供；亞布力旱煙，由黑龍江省哈爾濱市尚志市提供。

2.2 主要的試驗藥品

0.1 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液、蛋氨酸、750 μmol/LNBT、EDTA、20 μmol/L核黃素、石英砂、標準葡萄糖溶液(100 μg/mL)、蒽酮試劑、丙酮、無水乙醇、5%三氯乙酸溶液、0.5%硫代巴比妥溶液、高錳酸鉀、草酸等。

2.3 主要儀器

FA1004型電子分析天平、SHP-150A數顯生化培養箱、HH-8雙列八孔恒溫水浴鍋、UV752N紫外分光光度計、DGG-9076A烘箱、TZS-1K-G型號水分測定儀。

2.4 試驗設計與處理

盆栽試驗于2019年7～12月在遵義師范學院實驗基地進行。每盆裝土10 kg，施復合肥20 g。每個品種種植12盆。煙草幼苗移栽后，正常澆水，待煙草幼苗生長至對水分敏感期，開始控制澆水。處理前10 d，使土壤中的含水量占田間最大持水量的50%，使煙草幼苗處于中等干旱程度的脅迫；處理10～20 d，土壤中的含水量占田間最大持水量的30%，使煙草幼苗處于重度干旱脅迫；處理25 d后，對丙二醛、過氧化氫酶活性，相對電導率等相關指標進行測定。其他管理措施同大田。

2.5 試驗指標的測定

2.5.1 丙二醛含量的測定

硫代巴比妥酸法[13]。取0.5 g葉片加1.0 mL 0.1 mol/L磷酸，少量石英砂，冰浴研磨，定至5.0 mL試管，轉移至離心管，并在轉速為13000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取其上清液即為酶提取液。吸1.5 mL酶提取液于刻度試管中，加2.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸、5%三氯乙酸溶液，沸水浴10～15 min，迅速冷卻，轉移至離心管，于轉速為1800 r/min的離心機中離心10 min，取其上清液于532 nm、600 nm測定其吸光值。以蒸餾水調零。

結果計算：

MDA含量(μmoL/g)=

(1)

式(1)中：A:反應液總濃度(mL);V:提取液總量(mL);a:測定用提取液量(mL);W:材料重(g); 1.55×10-1:丙二醛微摩不消光系數。

2.5.2 超氧化物歧化酶活性

鄰苯三酚自氧化法[14]。取0.5 g葉片加1 mL 0.1 mol/L磷酸，少量石英砂，冰浴研磨，定至5.0 mL試管，轉移至離心管，并在轉速為13000 r/min 4 ℃條件下離心20 min，取其上清液即為酶提取液(表1)。

表1 超氧化物歧化酶活性反應體系

結果計算：

(2)

式(2)中：A0：照光對照管的光吸收值(Abs);AS：樣品管的光吸收值(Abs);VT：樣液總體積(mL);V1：測定時樣品用量(mL);FW：樣品鮮重(g)。

2.5.3 可溶性糖含量的測定

蒽酮硫酸法[15]。剪切新鮮煙草葉片樣品0.5 g，放入50 mL的三角瓶中，再加25 mL蒸餾水，沸水浴20 min，冷卻，過濾入100 mL容量瓶中，用熱水沖洗殘渣數次，定容至刻度。取樣品提取液0.5 mL加蒸餾水0.5 mL，再加蒽酮試劑5.0 mL于試管中搖勻，于620 nm處測定可溶性糖的吸光值。結果計算：

(3)

(4)

2.5.4 相對電導率測定

電導率法[16]。取大小相當的植物葉片(盡量保證葉片的完整性，少含莖節)，用自來水洗干凈后再用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干表面水分，將葉片剪成適宜長度的長條(避開主脈)，快速稱取鮮樣3份，每份0.1 g，分別置于10 mL去離子水的刻度試管中，蓋上玻璃塞，用ORIONTDS型電導儀測定葉片電導率。

結果計算：

(5)

式(6)中：R1：室溫下浸泡處理12 h后，浸提液電導率;R2：水浴鍋沸水浴30 min后，冷卻至室溫浸提液電導率。

2.5.5 過氧化氫酶的測定

高錳酸鉀滴定法[17]。 酶液提取:稱取剪碎混勻的新鮮煙草葉片1.0 g,置于研缽中，加0.2 g CaCO3和蒸餾水2.0 mL，仔細研磨成勻漿，移入100 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度，振蕩片刻，靜止，取上清液10.0 mL移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用。酶活性測定: 取100 mL三角瓶6個,編號。向各瓶準確加入稀釋后的酶液10.0 mL，立即向4號、5號、6號瓶中各加入3.6 mol/L H2SO4，5.0 mL以終止酶反應，作為空白測定。然后將各瓶放在20 ℃水浴中保溫。待瓶內溫度達到20 ℃時，向各瓶準確加入5.0 mL 0.1 mol/L H2O2搖勻，記錄時間。5 min后再依次向1號、2號、3號瓶各加入3.6 mol/L H2SO45.0 mL終止酶反應。然后向每瓶各加20%的KI 1.0 mL，3滴鉬酸銨及5滴淀粉指示劑。用0.02 mol/L Na2S2O3滴定至藍色消失。

結果計算：

(6)

式(6)中：A：滴定值(mL);B：樣品滴定值(mL);C：Na2S2O3濃度(mmol/L);a：測定時酶液用量(mL);V：酶液總體積(mL);W：樣品重(g);t：反應時間(min); 17：1/2H2O2的毫摩爾質量(mg)。 注意:所用K2MnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經過重新標定。

2.6 數據處理

利用Excel 2016對試驗前期數據進行進行整理與分析，利用SPSS24.0對數據進行統計與分析，使用Origin8.5進行作圖。

3 結果與分析

3.1 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛含量的高低可以間接反映出煙草植株膜系統受害程度，以及煙草植株的抗逆性強弱。從圖1可以看出，亞布力旱煙的丙二醛含量為65.43 μmol/g，云煙87的丙二醛含量是45.47 μmol/g，亞布力旱煙的丙二醛含量較云煙87高43.90% μmol/g，差異達顯著水平。這說明，在干旱脅迫的條件下，亞布力旱煙細胞質膜受到破壞的程度明顯高于云煙87，受干旱脅迫的危害程度較重。

圖1 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗丙二醛含量的影響

3.2 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗細胞膜透性的影響

相對電導率越高，干旱脅迫對煙草幼苗葉片細胞膜的傷害越嚴重，其抗旱性越差。由圖2可知，亞布力旱煙和云煙87在連續干旱脅迫的條件下，亞布力旱煙和云煙87的相對電導率分別為0.42 μs/cm和0.19 μs/cm，亞布力旱煙較云煙87高121.05%，差異達顯著水平。由此可以看出，云煙87較亞布力旱煙具有更強的抗旱能力。

圖2 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗細胞膜透性的影響

3.3 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

在干旱脅迫的逆境中，煙草可通過抗氧化酶系統對煙草體內的活性氧進行清除，為煙草完成正常的生理活動代謝提供了一定的保障。從圖3可以看出，在干旱脅迫的條件下，云煙87的SOD活性明顯高于亞布力旱煙；其中，亞布力旱煙和云煙87的SOD活性分別為5.89 μ/g、13.13 μ/g，亞布力旱煙較云煙87的SOD活性降低了55.14%，差異達顯著水平。由此可知，在干旱脅迫的條件下，云煙87的SOD活性所作出的生理響應更為顯著，從而提高了云煙87的抗旱性。

圖3 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

3.4 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶活性的高低與植物的代謝強度及其抗性有著密切的關系。由圖4可以看出，亞布力旱煙幼苗體內的CAT酶活性為1.52 μmol/(g·min)，云煙87的過氧化氫酶活性為3.21 μmol/(g·min)，亞布力旱煙較云煙87低了52.65%，兩者差異達顯著水平。這說明，在干旱脅迫條件下，云煙87過氧化氫酶的活性明顯高于亞布力旱煙，其能更好地清除過氧化氫對植物體本身造成的傷害，從而表現出更強的抗旱性。

圖4 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗過氧化氫酶活性的影響

3.5 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗可溶性糖含量的影響

在逆境中，植物的可溶性糖含量越高，細胞失水的可能性越小，成活的可能性越大，抗逆性越強。由圖5可以看出，在干旱脅迫的條件下，云煙87的可溶性糖含量明顯高于亞布力旱煙，其值分別為125.99 μg/mL、77.90 μg/mL，亞布力旱煙較云煙87低了38.17%。由此可知，與亞布力旱煙相比，受干旱脅迫的云煙87對可溶性糖含量具有較強的調控能力，從而降低了干旱脅迫的危害，這與SOD酶活性和CAT酶活性的變化規律相一致。

圖5 干旱脅迫對不同煙草品種幼苗可溶性糖含量的影響

4 結論與討論

中國大部分煙區多位于干旱、半干旱環境中。由于缺乏必要的灌溉條件，每年總有部分地區烤煙受旱災危害嚴重。陸德彪等[18]研究表明，干旱脅迫條件下，相對電導率、丙二醛含量及抗氧化酶活性等均能夠很好地表征植物抗旱性的強弱。本試驗結果表明，在干旱脅迫的條件下，亞布力旱煙的相對電導率、丙二醛含量相對較高，這可能是由于干旱脅迫使亞布力旱煙細胞膜受害較為嚴重，滲透勢增強，受害程度較重，表現出對干旱脅迫較弱的適應性。

在逆境條件下，過氧化氫酶及超氧化物歧化酶等是植株體內清除活性氧的重要保護酶。陸德彪等[18]研究表明，在逆境條件下，抗旱性較強的品種通過快速提高酶的活性，及時清除細胞中的過氧化氫、超氧陰離子自由基等有害物質，以避免其對細胞造成的過度損傷。在干旱脅迫條件下，云煙87的CAT酶活性、SOD酶活性均明顯地高于亞布力旱煙，這說明云煙87較亞布力旱煙更能夠有效地清除煙草體內的活性氧物質對植物體本身造成的傷害，從而表現出較強的抗旱性。此外，在干旱脅迫的條件下，植物體可以通過提高可溶性糖的含量來提高細胞液的濃度，降低其滲透勢，保持其體內的水分，維持正常的生理代謝活動。本試驗研究結果表明，在干旱脅迫的條件下，云煙87的可溶性糖含量明顯高于亞布力旱煙，這與SOD酶活性和CAT酶活性的變化相一致，說明云煙87較亞布力旱煙具有更強的自我調節能力，以減緩干旱脅迫造成的危害，對干旱脅迫表現出更強的抗耐性。