KCNK1調節CREB3表達抑制肺癌細胞的增殖和轉移

閆紅江 高偉年 高少林 朱海勇 石彥濤 張合林

全球范圍內，肺癌是所有癌癥中發病率和死亡率排名第一位的癌種[1]，肺癌也是我國最常見的腫瘤[2]。近年來，通過大規模的基因組研究，對肺癌尤其是肺腺癌的分子機制的認識有了顯著的進展[3]；并且已經找到一些重要的治療靶點，如，EGFR和ALK，開發出的靶向藥物的臨床應用顯著改善了肺癌患者的生存率和預后[4,5]。但是，靶向藥的應用也面臨著挑戰：臨床使用含靶向藥的治療方案后，患者經常出現不良反應、耐藥性或是其他的并發癥[6-8]。在肺癌的不同階段，基因會發生上調或下調的不同改變，了解肺癌發生和進展的分子機制對于肺癌的診治具有重要的意義，有助于尋找開發新的診斷和治療的靶點，提高治療效果，改善患者的預后。K2P K+通道是一類結構獨特的離子通道家族，參與多種生理功能的調節，如細胞體積、細胞凋亡、血管舒張、神經元興奮和疼痛感知；該類家族成員是多種心血管和神經疾病的治療靶點及揮發性麻醉藥的主要作用靶點[9-11]。鉀雙孔域通道亞家族K成員1(KCNK1)(K2P1/TWIK-1)是該家族第一個被鑒定的成員，在心臟和大腦的重要生理過程中發揮作用[12-15]。目前KCNK1在腫瘤中的功能和機制還不清楚。本研究探討KCNK1在肺癌中的功能及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 H1975和H1299細胞購自中科院上海細胞庫；細胞培養基Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)和2.5%胰酶購自hyclone；胎牛血清購自Gibco；細胞培養用1%青霉素-鏈霉素抗體購自Gibco；Trizol購自英韋創津；細胞凋亡試劑盒購自Sigma-aldrich，RNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自Takara；蛋白質裂解液購自北京碧云天生物科技有限公司。細胞增殖與毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit，CCK-8)購自翌圣生物科技(上海)有限公司；Transwell小室試劑盒購自康寧公司；重組Anti-CREB3抗體(ab180119)和Anti-GAPDH抗體(ab8245)均購自艾博抗生物科技有限公司。辣根過氧化物過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗購自中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：H1975和H1129細胞培養于添加10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養基中，于含5%二氧化碳，37℃細胞培養箱中進行培養。細胞每隔3 d進行換液。

1.2.2 KCNK1基因細胞敲減：設計合成特異性KCNK1基因的siRNA靶序列并進行驗證，siKCNK1干擾序列和對照siRNA分別轉染A549和NCI-H1299細胞，取20 nmol/L siRNA加入200 μl 轉染用培養液中，于室溫下靜置15 min。之后取4 μl RNAiMAX溶液逐滴加入之前配好的轉染用培養液中，室溫下靜置15 min。最后將兩者輕輕混勻，于室溫下靜置15 min。將上述混合液輕輕加入帶感染的細胞中，于含5%二氧化碳，37℃細胞培養箱中進行培養48 h。棄去樣本，收集細胞，并提取細胞總mRNA，進一步進行逆轉錄成cDNA。通過qPCR實驗檢測KCNK1表達驗證siRNA的敲減效率。KCNK1基因敲減靶基因序列如下：5’-CCTTGTCAGATGGAGGTAA-3’; 對照siRNA序列為：5’-CACACCGTTTCGTGGCTTT-3’。SiRNA干擾序列購自湖州河馬生物科技有限公司。

1.2.3 RNA提取與qPCR實驗：使用TRIZOL裂解細胞，使用酚氯仿法提取1×106細胞的總RNA，溶于30 μl無RNase的ddH2O中。然后用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA后，使用qPCR試劑盒進行qPCR實驗。KCNK1上游引物：5’-CCTGGGGAAGGCTACAATCAA-3’；KCNK1下游：5’-CCAGAACTACCAACATGGCAA-3’。AP-1上游：5’-TCCAAGTGCCGAAAAAGGAAG；AP-1下游：5’-CGAGTTCTGAGCTTTCAAGGT-3’。MMP-9上游：5’-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3’；MMP-9下游：5’-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT-3’。Cyclin D3上游：5’-TACCCGCCATCCATGATCG-3’；下游：5’-AGGCAGTCCACTTCAGTGC-3’。GAPDH引物設計如下：上游：5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’；下游：5’-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’。

1.2.4 TCGA數據庫：KCNK1基因在肺腺癌中的表達水平通過TCGA數據庫進行查詢并下載數據進行分析，TCGA數據庫分析的網址為http://cancergenome.nih.gov。

1.2.5 細胞增殖實驗：將KCNK1干擾組和對照組的處于對數生長期的細胞的H1299和H1975細胞，按照每孔1 000個細胞接種于96孔板，每孔100 μl培養液，于含5%二氧化碳，37℃細胞培養箱中進行培養。第2天開始，相應的培養孔中加入10 μl CCK8試劑，于37°C下孵育3 h，采用450 nm單波長進行吸光度測定，OD值代表細胞增殖活力。連續檢測4 d，計算細胞活率。

1.2.6 細胞克隆形成實驗:將處于對數生長期的細胞均勻接種于6孔板，每孔1 000個細胞。每隔3 d進行換液，連續培養15 d待細胞形成克隆之后棄去培養基，PBS洗滌兩次之后使用結晶紫染色3 h，晾干后拍照，統計。

1.2.7 Western blot檢測:6孔板培養的細胞棄去培養基，PBS洗滌2次。加入200 μl RIPA后使用細胞刮將細胞刮下裂解提取蛋白。取50 μg蛋白變性處理后進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳，電泳條件為恒壓120 V。待溴酚藍電泳至凝膠末端，電泳完畢。將蛋白轉移至PVDF膜，電轉條件恒流300 mA，3 h。PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉，封閉條件為室溫2 h。之后分別進行一抗和二抗抗體孵育，一抗(稀釋比例為1∶1 000)于4℃孵育過夜，二抗(稀釋比例為1∶5 000)于室溫孵育2 h，最后進行顯色分析。

1.2.8 Transwell:收集處于對數期的細胞，使用無血清培養基重選細胞。將細胞接種于Transwell小室內室，每小時接種40000細胞，培養基體積為750 μl。外室中添加500 μl含20%胎牛血清的培養基。培養48 h 后，使用結晶紫對細胞進行染色。

2 結果

2.1 KCNK1在肺癌組織中高表達 通過對TCGA數據庫中肺癌數據下載數據并進行分析，發現KCNK1在肺腺癌組織中呈高表達，在肺癌腫瘤組織中的表達水平顯著高于其對照癌旁或正常組織中的表達水平(P<0.05)。而在486例肺鱗癌的樣本中分析發現，KCNK1的表達也顯著升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 TCGA數據庫分析發現KCNK1在肺癌組織中高表達；A TCGA數據庫分析KCNK1在肺腺癌及正常對照中的表達水平，*P<0.05；B TCGA數據庫分析KCNK1在肺鱗癌及正常對照中的表達水平，*P<0.05

2.2 KCNK1促進肺腺癌的增殖能力 應用siRNA敲低KCNK1基因的表達，成功在肺腺癌細胞系H1975和H1299細胞系中將KCNK1基因沉默，和對照組相比，KCNK1在H1975和H1299細胞系中的敲減效率分別達到73.7%和77.0%。CCK8增殖實驗檢測發現，KCNK1基因沉默可以顯著的抑制H1975和H1299細胞的增殖能力。克隆形成結果顯示，干擾KCNK1可以顯著的抑制肺癌細胞的克隆形成能力。說明KCNK1對肺癌細胞增殖能力是必不可少的。見表1～4，圖2。

表1 H1975和H1299中KCNK1干擾效率比較

表2 CCK8檢測敲減KCNK1對H1975增殖能力比較

表3 CCK8檢測敲減KCNK1對H1299增殖能力比較

圖2 細胞克隆形成實驗顯示KCNK1敲低后可抑制肺腺癌H1975和H1299細胞的克隆形成；A 克隆形成檢測干擾KCNK1對H1975細胞克隆形成能力的影響；B 克隆形成檢測干擾KCNK1對H1299細胞克隆形成能力的影響

表4 克隆形成檢測敲減KCNK1對H1975和H1299克隆形成能力比較

2.3 干擾KCNK1抑制肺癌細胞的轉移能力 Transwell結果顯示干擾KCNK1可以顯著的抑制H1975和H1299細胞的轉移能力，提示KCNK1參與肺癌細胞的轉移。見圖3，表5。

表5 Trasnwell檢測敲減KCNK1對H1975和H1299細胞的轉移能力

圖3 干擾KCNK1抑制肺癌細胞H1975和H1299的轉移；A Transwell結果顯示干擾KCNK1對H1975細胞轉移能力的影響(×40)；B Transwell結果顯示干擾KCNK1對H1299細胞轉移能力的影響(×40)

2.4 KCNK1可以調控CREB3的水平 將KCNK1干擾后，通過Western blot實驗檢測KCNK1的下游通路基因表達水平，發現與對照組相比，KCNK1基因沉默組的CREB3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；qPCR檢測CREB3下游AP1、MMP9和cyclin D3表達，發現與對照組相比3個基因表達水平都明顯下降(P<0.05)；說明KCNK1基因表達沉默后可以抑制H1975細胞CREB3及其下游分子AP1、MMP9和cyclin D3的表達。見表6，圖4。

圖4 干擾KCNK1抑制H1975和H1299細胞CREB3蛋白的表達

表6 qPCR檢測干擾KCNK1對H1975細胞AP1、MMP-9和Cyclin D3的表達水平

3 討論

離子通道在可興奮細胞(如心肌細胞和神經元)的生理和病理狀態下均發揮重要的功能[13,14]。隨著研究的深入，發現離子通道在腫瘤的增殖，轉移及耐藥等過程中的作用也非常重要，離子通道在驅動惡性腫瘤細胞行為中的具有多種功能。鉀離子通道是離子通道中最具多樣性的一類，已有的研究發現多種鉀離子通道相關基因參與腫瘤的形成和惡性進展：Kv1.1的高表達是多種亞型髓母細胞瘤致病因素[16]；在乳腺癌、結腸癌和前列腺癌組織中檢測到Kv1.3表達明顯升高[17]；Kv10.1(EAG1)被發現在多種腫瘤中高表達[18]；K2P家族成員KCNK9在多種腫瘤表達升高，其單克隆抗體可以在細胞水平抑制增殖和侵襲轉移[19]。因此，鉀離子通道相關分子作為個體化癌癥治療的靶點具有巨大的潛力。

KCNK1是鉀二孔域通道家族K成員，可以維持靜息電位，調節動作電位平臺的振幅和持續時間，改變膜電位和膜興奮性。本研究首先在TCGA數據庫中研究發現，KCNK1在肺腺癌和肺鱗癌的組織樣本中高表達均顯著上調，提示KCNK1可能作為肺癌的潛在的診斷分子標志物。在甲狀腺癌樣本中檢測發現，KCNK1的mRNA水平在甲狀腺癌的組織中表達上調，并且和腫瘤的分級呈正相關[20]，提示KCNK1在甲狀腺癌中可能發揮促進腫瘤惡性表型的作用。因此KCNK1可能作為廣譜的腫瘤惡性分子標志物。此外，Jiang等[21]研究發現該家族的另外一個成員KCNK4在胰腺癌細胞中高表達，并且高表達KCNK4與胰腺癌的不良預后相關。

目前研究筆者尚未見KCNK1在肺癌中作用機制的報道。本研究進一步探討干擾KCNK1對肺癌細胞的惡性表型的影響。結果顯示，利用siRNA沉默KCNK1的表達后發現，肺癌NCI-H1975和NCI-H1299細胞的增殖能力和遷移能力受到顯著抑制。細胞遷移能力在一定程度上反映了腫瘤的轉移能力，因此KCNK1可能在對肺癌的轉移能力起到關鍵作用。因此，以上結果說明KCNK1可以參與肺癌的發生和轉移。但是Beitzinger等[22]研究發現TAp73可以直接結合并調控KCNK1的轉錄，對腫瘤的鉚釘生長起到關鍵作用，并且在大樣本組織中研究發現，KCNK1在膠質瘤，黑色素瘤等腫瘤中表達下調，提示KCNK1在不同腫瘤類型中的功能有一定的差異。因此在多種腫瘤中闡明KCNK1的作用機制對闡明KCNK1的生物學功能至關重要。

造成KCNK1在不同腫瘤中功能不意義的可能原因之一是其下游介導的信號通路或者下游分子在不同類型的腫瘤中不同。本研究進一步對其下游作用機制研究中發現：KCNK1干擾后CREB3蛋白水平顯著降低。CREB3也稱為LZIP 或 LUMAN，是CREB/ATF轉錄因子家族成員，已有報道CREB可以通過調控AP1在多種腫瘤中發揮作用[23,24]。我們通過qPCR檢測發現KCNK1干擾后AP1、MMP9和cyclin D3的表達也明顯降低。AP1又成c-Jun，是真核細胞內重要的轉錄因子，轉錄激活促進增殖相關的基因轉錄。而MMP9為基質金屬蛋白酶家族成員，可以降解細胞外機制，從而促進細胞的運動和轉移能力。同時，高表達的Ccylin D3可以推進細胞周期進展。由此可見，從分子層面證明KCNK1可能促進肺癌細胞的增殖能力，遷移能力，并促進細胞周期進程。因此，本研究的機制研究結果說明KCNK1可能通過CREB3在肺癌發生和惡性進展中發揮作用。

綜上所述，KCNK1基因可能是肺癌的一個新的分子診斷指標及治療靶點。KCNK1基因在肺癌的腫瘤形成與惡性進展中有著重要的功能，并且可能可能通過影響CREB3及其下游機制進行，進一步的研究有待進行。本研究只通過TCGA分析KCNK1的mRNA表達水平，但還需在肺癌組織中檢測KCNK1蛋白表達與肺癌臨床指標和患者預后的關聯度。本研究發現KCNK1可以促進Cyclin D3的表達，但對細胞周期進程的促進換需要進一步通過流式細胞術等方法來進一步明確。重要的是，本研究只在細胞水平上進行了探討，進一步換需要在動物體內水平探討KCNK1對肺癌細胞的增殖和轉移能力。并且分子層面上KCNK1基因如何調控CREB3等問題需要繼續深入研究。