欖香烯放射治療增敏作用機制的研究進展

吳文博 段國辰

據世界衛生組織(WHO)發布的2018年最新全球癌癥統計數據顯示,2018年全球新增1 810萬例癌癥病例,死亡人數高達約960萬[1]。據國家癌癥臨床研究中心最新報道，在過去的半個世紀，我國所有癌癥的發病率和死亡率在不斷增加，癌癥已成為我國主要的死亡原因[2]。放射治療是治療惡性腫瘤的主要治療手段之一[3]。臨床上，由于臨近正常組織對射線耐受劑量的限制，很難達到抗腫瘤所需要的足夠照射劑量,由此造成治療的失敗,因此,如何增加腫瘤對射線的敏感性，即在不損傷正常組織的前提下，在較低放射劑量下如何實現較高的治療效果，是臨床腫瘤放射治療面臨的最突出問題。近年來，中藥的抗腫瘤作用日益被大家所關注，欖香烯是我國從姜科植物溫郁金的根莖中自主提取的具有抗腫瘤活性的中藥，是一種萜烯類化合物，對欖香烯基礎研究方面的大量循證醫學證據證實欖香烯具有毒副作用小、抗瘤譜廣、臨床療效確切等特點[4]。近年來，欖香烯作為放射治療增敏劑，臨床增敏效果已得到認可，但其增敏作用機制是國內外研究的重點和熱點，通過閱讀國內外文獻，搜集整理，歸納出欖香烯的放射治療增敏作用機制如下。

1 影響腫瘤細胞DNA雙鏈損傷修復

DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)是由DNA-PKcs、Ku70和Ku80 3個亞基組成，其參與多種細胞通路，已成為癌癥的治療靶點，在細胞DNA雙鏈斷裂的修復(DSB)、DNA損傷的應答中起到關鍵作用，因此DNA-PK在維持基因組完整性方面起著重要作用[5-7]。

有研究發現欖香烯在干擾放射治療致腫瘤細胞 DNA雙鏈損傷修復而發揮增敏作用，通過克隆形成實驗觀察β-欖香烯對肺腺癌A549細胞放射敏感性影響,采用彗星分析法探討其損傷修復的作用機制，結果發現β-欖香烯與放射治療療聯合作用于A549細胞時，對細胞DNA損傷明顯增加，并對其修復有明顯的抑制作用，提示其增敏作用機制與β-欖香烯對細胞的DNA放射損傷及修復作用有關[1]。田瑩瑩等[8,9]研究發現抑制Ku70、Ku80參與的雙鏈損傷修復途徑可能是β-欖香烯放療增敏的作用機制。張卓等[10,11]報道，欖香烯對A549細胞具有放射增敏作用，其分子機制可能與下調DNA-PKcs基因表達抑制DSB修復和下調凋亡抑制基因Bcl-2、上調凋亡基因P53表達促進細胞凋亡有關。在多形性膠質母細胞瘤中也證實了欖香烯的放療增敏作用，Liu等[12]在β-欖香烯通過抑制ATM信號通路增強多形性膠質母細胞瘤(GBM)的放射敏感性和化學敏感性實驗研究中提出β-欖香烯通過抑制ATM信號通路的活化來減少 DNA 損傷修復，從而增強 GBM 細胞對放療的敏感性。

2 阻滯細胞周期的運轉

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期2個階段。間期又分為3期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細胞分裂期即M期。在細胞周期中有兩個決定性階段，即G1/S期和G2/M期。近年來在欖香烯放射治療增敏方面的研究尤以G2/M期阻滯較為突出。

在腦膠質瘤的實驗研究中，丁華等[13]采用不同濃度的欖香烯作用于腦膠質瘤SHG-44細胞株，證明了欖香烯對腦膠質瘤SHG-44細胞株有肯定的增殖抑制作用,其放射治療的增敏機制與G2/M期細胞比例增加、S 期細胞比例減少及抑制Bcl-2蛋白表達誘導腫瘤細胞凋亡有關。關曉燕[14]在欖香烯對人膠質瘤U251細胞株體外放射治療增敏機制研究中發現欖香烯通過降低p-cdc2(Thr161)、cdc2及放射誘導的cyclinB1表達來誘導細胞G2/M期阻滯進而增加人膠質瘤U251細胞體外放射治療的敏感性。在肝癌的實驗研究中，楊道科等[15]研究發現，β-欖香烯并非由單一機制引起增敏作用，與G2/M期阻滯作用和誘導細胞凋亡有密切關系。在胃癌的實驗研究中，賀任才等[16]研究發現，β-欖香烯增強了胃癌MKN28細胞的放射治療敏感性。從機制上講，β-欖香烯主要通過誘導G2/M期阻滯、抑制亞致死性損傷修復和誘導細胞凋亡來增強放射治療的殺傷作用，從而影響MKN28細胞的細胞周期分布而發揮增敏作用。

研究者也在肺腺癌細胞及結腸癌細胞中證實欖香烯的放射治療的增敏作用，周興芹[17]通過體外實驗發現，欖香烯乳對肺癌A549細胞的放療增敏作用機制可能與欖香烯乳引起細胞G2/M期阻滯及調控凋亡相關蛋白(Bcl-2蛋白及Bax蛋白)表達,誘導凋亡有關。張明等[18]在β-欖香烯對結腸癌SW480細胞放射治療增敏作用實驗研究中發現，β-欖香烯是通過抑制PI3K/Akt信號通路激活,引起G2/M期阻滯及促進細胞凋亡相關蛋白表達來提高對SW480細胞的放射敏感性。

3 抑制腫瘤血管形成

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)為腫瘤發生發展過程中調節和促進血管再生的最重要細胞因子,在腫瘤細胞的增殖、遷移、抗凋亡、血管生成中發揮了重要作用[19]。臨床研究已經證實,腫瘤組織具有血管依賴性,其中微血管密度(microvascular density,MVD)是反映腫瘤組織血管生成效應的最主要參數,MVD被作為判斷腫瘤血管生成的“金標準”,而且與腫瘤的侵襲性及預后密切相關[20,21]。

樊輝等[22-24]均通過β-欖香烯作用于A549肺腺癌移植瘤進行實驗研究，3個實驗均出現一致的結果，即單純用藥組的抑瘤能力較弱，而其與放射治療聯合應用時，抑瘤效果得到顯著放大，體現出明顯的放療增敏作用，Western blot及免疫組化分析結果顯示，單純放療后血管內皮生長因子(VEGF)和微血管密度(MVD)表達水平明顯提高，而β-欖香烯與放射治療聯合作用時，VEGF和MVD表達水平受到顯著抑制，結果證明β-欖香烯在此移植瘤模型中，通過抑制血管內皮生長因子VEGF的表達和下調微血管密度MVD，改善腫瘤血管而發揮放射治療的增敏作用。

同樣，有研究者也在乳腺癌細胞移植瘤及宮頸癌細胞證實了β-欖香烯的放射治療增敏作用。龔敏等[25]在β-欖香烯對小鼠乳腺癌移植瘤放射治療的增敏效果及對血管形成的影響實驗研究中發現，β-欖香烯可作為乳腺癌放射治療的有效增敏劑,同時可有效的降低VEGF和MVD的表達,從而抑制腫瘤內微血管的形成。張思[26]在β-欖香烯對人宮頸癌Hela乏氧細胞放射治療增敏作用實驗研究中通過RT-PCR和細胞免疫組化SP方法表明VEGF及HIF-1αmRNA和蛋白表達水平在單純放射治療組明顯增高，而在聯合組中其表達受到顯著抑制，提示β-欖香烯對人宮頸癌Hela乏氧細胞的增敏作用機制可能是通過抑制HIF-1α與VEGF表達，進而抑制腫瘤血管生成。

4 誘導腫瘤細胞凋亡

在眾多的凋亡調控基因中Bcl-2蛋白家族、caspase家族和IAP家族最受關注。Bcl-2蛋白家族是一類特別的凋亡調控家族，主要通過作用于線粒體和內質網來調控細胞凋亡，其成員中有一部分可促進細胞凋亡，如Bax、Bad、Bid，而還有些成員阻止凋亡,如Bcl-2、 Bcl-w、Bcl-x[27-29]。Caspase(半胱氨酸天冬氨酸酶)也是一種促使細胞凋亡的蛋白酶，在細胞凋亡機制網絡中位于核心地位，其中 Caspase-3在細胞凋亡的調控機制中處于核心位置，作為關鍵的細胞凋亡執行者，激活Caspase-3并促進其表達是凋亡信號傳導通路中的關鍵的環節[30]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中蛋白分子量最小的成員,結構獨特,具有抑制細胞凋亡和調節細胞有絲分裂的雙重功能；Livin是IAP家族的新成員，也是一種抗凋亡蛋白，Survivin、Livin基因廣泛表達于各種惡性腫瘤中，但在正常的組織細胞中不表達或者低表達[31,32]。

4.1 調節Bcl-2家族相關基因蛋白表達 在對宮頸癌HeLa細胞體外實驗研究中，曾春生等[33,34]發現，欖香烯能顯著提高HeLa細胞的放射敏感性，與促進Bax表達,下調Bcl-2表達及上調p53參與細胞凋亡調節相關。在肺癌和腎癌方面的實驗研究也與上述結論一致，據肺癌的體外實驗研究報道[35]，β-欖香烯具有良好的放射增敏作用，其機制可能與上調p53、下調Bcl2，誘導細胞凋亡有關。王子明等[36]在β-欖香烯對人腎癌裸鼠移植瘤的放療增敏作用及相關基因表達變化研究中發現，β-欖香烯放療增敏的機制與改變 Bcl-2/Bax 比例誘導腎癌細胞凋亡有關。

4.2 上調Caspases蛋白酶活性 文蘭香等[37]在β-欖香烯聯合卡鉑對結腸癌SW480細胞放射治療增敏作用的實驗研究中發現，β-欖香烯聯合卡鉑能增加結腸癌SW480細胞放射治療敏感性,抑制結腸癌SW480細胞增殖、侵襲水平,提高凋亡水平,其機制與β-欖香烯聯合卡鉑能促進SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA和蛋白高表達有關。佘軍軍等[38]在β-欖香烯對兔VX2腎癌放射治療增敏作用中Caspase-3及Bcl-2的表達實驗研究中通過免疫組化方法發現，空白組Caspase-3蛋白表達為陰性，與單純放射治療組比較，增敏組為中等陽性且差異有統計學意義(P<0.05)。表明欖香烯對兔VX2腎癌具有放射治療增敏，與上調Caspase-3表達相關。

4.3 抑制凋亡相關蛋白IAP家族的表達 李小龍等[39,40]先后用β-欖香烯作用于人肺腺癌裸鼠移植瘤探索放射治療增敏機制，均通過免疫組織化學染色檢測各組Survivin的表達，在2個實驗研究中均發現β-欖香烯具有明確的放射治療增敏作用,依據免疫組化半定量分析方法結果顯示,與其他各組相比較，欖香烯與放射治療聯合組中Survivin的表達明顯降低(P<0.05)；而與單純空白對照組比較，單獨放療組Survivin的表達明顯增強(P<0.05)，表明β-欖香烯可能通過下調Survivin的表達,而達到放射治療增敏的作用。佟恩娟[41]隨后在研究乏氧肺癌細胞體外實驗中也得出欖香烯可能下調HIF-1α/Survivin通道來促進細胞凋亡，由此來發揮乏氧肺癌細胞的放射增敏作用。

汪鳳等[42]在欖香烯對人膠質瘤U251細胞的放射增敏機制實驗研究中發現，欖香烯可能通過下調Cdc2蛋白、降低cyclin B1表達、抑制cylcin B-Cdc2復合物的形成、下調Survivin表達等方面增強U251細胞對放療的敏感性。

趙慶濤等[43]在β-欖香烯聯合照射對肺腺癌A549細胞凋亡及Livin基因表達的影響實驗研究中發現，與單純放射和單純用藥欖香烯組比較，欖香烯與放射聯合組A549細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)，結合PCR結果顯示與單純放射組相比，聯合組Livin基因mRNA表達量顯著下降 (P<0.01)，表明β-欖香烯乳具有放射增敏作用，其增敏機制與抑制A549細胞增殖，下調凋亡基因Livin的表達,促進A549細胞凋亡有關。

5 臨床應用

欖香烯具有較好的放射治療增敏作用，能發揮穩定的抗腫瘤效果，目前欖香烯聯合放射治療在惡性腫瘤的臨床應用上已取得了一定的進展。

錢靜等[44]通過對老年食管癌患者在放療期間增加口服欖香烯乳，來評估觀察近期療效時發現同步加量調強放療聯合欖香烯口服乳治療老年食管癌近期療效較好,患者易耐受,費用較為適中。楊梅等[45]通過欖香烯乳注射液聯合全顱放療治療乳腺癌腦轉移患者，結果發現欖香烯乳注射液與放射治療聯合治療乳腺癌腦轉移具有協同作用,不但可以改善患者癥狀,且不良反應較輕。王記南[46]通過欖香烯乳注射液聯合放射治療對骨轉移癌疼痛的臨床療效觀察，發現聯合欖香烯乳注射液對骨轉移癌疼痛放射治療效果顯著,優于單純的放射治療,可在臨床上推廣應用。高忠媛[47]在欖香烯同步放射治療對宮頸癌不良反應的臨床研究中發現，放射治療同時應用欖香烯注射液在預防骨髓抑制不良反應中起到積極作用。

還有臨床研究人員對肺癌腦轉移患者進行了系列研究報道，宦佳樂等[48]發現欖香烯注射液聯合放射治療不僅能有效提高肺癌腦轉移患者的治療反應率,而且有效的減少患者的不良反應，提示欖香烯注射液與放射治療聯合治療肺癌腦轉移具有很好的臨床應用價值。Sun等[49]研究發現，將欖香烯與全腦放療聯合應用于肺癌多發腦轉移患者后，與單獨進行全腦放療的對照組相比，試驗組患者的1年生存率為30.0%，中位OS持續時間為9個月，而對照組分別為21.9%和7.1個月，神經系統無進展生存期(n PFS)在試驗組和對照組分別為5.2個月和3.7個月(均P<0.05)；值得注意的是，接受欖香烯與全腦放療聯合應用的患者與單獨進行全腦放療的患者相比，頭痛的發生率明顯減少(P<0.05)。提示了欖香烯聯合全腦放射治療肺癌多發腦轉移患者，可延長nPFS，減少頭痛的發生率，提高患者的生活質量。一項包含765例肺癌腦轉移患者的薈萃分析表明，與單純放療組的患者比較，接受欖香烯注射液聯合放療的患者客觀緩解率(ORR)有更大的改善；而且聯合組患者在骨髓抑制及白細胞減少癥等不良反應的發生率方面明顯低于單純放療組，差異均有統計學意義(P<0.05)，以上說明了欖香烯注射液聯合放射治療肺癌腦轉移患者可以提高治療效果，減輕患者的癥狀，并減少放療引起的不良反應[50]。

此外，很多患者因長期接受放射治療后,造成機體免疫功能降低,導致放療毒副作用增加,因而無法耐受放療進程,有相當一部分患者甚至被迫選擇中止放療,而當中止放療后,機體內殘留的腫瘤細胞往往會迅速增殖,進而導致腫瘤的浸潤、轉移,最終影響患者的預后。機體的免疫功能在抵御腫瘤過程中發揮著重要作用，有不少臨床研究表明欖香烯聯合放療可明顯改變和增強腫瘤細胞的免疫原性,誘發和促進機體對腫瘤細胞的免疫反應。

腫瘤的復發、侵襲及轉移是影響癌癥患者預后的關鍵因素，腫瘤細胞的運動和黏附能力與瘤細胞浸潤和轉移密切相關。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一個大家族，MMP-2和MMP-9是其主要成員，可對纖維粘連蛋白、彈性蛋白及Ⅳ型膠原等細胞外基質成分降解，對腫瘤細胞的侵襲及轉移有促進作用[53]。鄭瑞明等[54]研究發現，將欖香烯注射液聯合放療應用于原發性肝癌患者觀察近期療效，結果顯示，與單一使用放射治療的對照組患者比較，欖香烯注射液聯合放療的觀察組患者總有效率顯著增高；對照組治療前后MMP-2和MMP-9血清濃度分別下降(46.28±10.12)ng/L和(39.66±9.43)ng/L，觀察組分別下降(89.36±11.03)ng/L和(85.28±8.32)ng/L，與對照組比較，觀察組治療前后MMP-2和MMP-9血清濃度的下降程度明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。還有臨床研究人員比較了欖香烯注射液聯合放療與單獨放療在晚期肺癌、食管癌患者的近期療效，結果顯示，欖香烯注射液聯合放療可以有效提高肺癌、食管癌患者的治療后部分緩解率及完全緩解率，治療前2組患者的血清MMP-2和MMP-9水平差異無統計學意義(P>0.05),而觀察組患者接受治療后的血清MMP-2及MMP-9含量明顯低于對照組患者，差異有統計學意義(P<0.05)[51,55]。以上提示使用欖香烯注射液聯合放療較單一放射治療方式效果更優，可以有效抑制MMP-2和MMP-9介導的腫瘤轉移過程,對抑制腫瘤的進展具有重要作用。

綜上所述，欖香烯對腫瘤的放射治療增敏作用機制主要是影響DNA雙鏈損傷修復、阻滯細胞周期(主要G2/M期)、抑制腫瘤血管形成、誘導腫瘤細胞凋亡等，體現了其廣譜而有效的特點。目前雖然對欖香烯放射治療增敏作用的分子機制有了一定認識，但仍還存在一些不足之處。首先，由于不同的實驗細胞株和實驗動物對藥物及放射治療敏感性不一致，以及不是在完全相同的實驗條件下進行的研究，難免導致相關基因及蛋白表達的研究結果并不完全一致。其次，欖香烯作為增敏劑的實驗研究仍然偏少，其已發現的放射治療增敏作用分子機制，也僅僅局限于某些腫瘤，因此應擴大各個腫瘤的體外細胞實驗和體內動物腫瘤模型實驗，一方面可以驗證已發現的增敏作用分子機制是否在其他腫瘤上也存在同樣效應，另一方面可由此來探索更多潛在未知的放射治療增敏作用分子機制。

隨著進一步的深入研究，相信將會有更多欖香烯抗腫瘤細胞的放射治療增敏作用機制被發現，建議從已發現欖香烯放射治療增敏作用機制的分子水平入手，尤其在某一基因水平的上下游基因方面，探索發揮增敏機制作用的內在聯系，從而發現欖香烯新的放射治療增敏作用靶點。