米糠脂肪烷醇中高級脂肪烷醇檢測方法的研究

陳麗娥 董曉尉 徐廣偉 郭躍平

摘 要：建立了氣相色譜外標法與內標法檢測米糠脂肪烷醇中高級脂肪烷醇的含量，并對兩種方法進行了比較。外標法中，樣品經甲苯30 ℃超聲提取，采用HP-5色譜柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm）分離，用標準曲線測定含量;內標法中，樣品經甲苯提取后，加入一定濃度的鄰苯二甲酸二葵酯作為內標物，用標準曲線內標法測定。結果表明，在0.01～0.20 mg/mL

范圍內，兩種方法中2種目標化合物都呈良好的線性關系，相關系數（r2）大于0.99，檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.07%、0.08%和0.20%、0.25%;3個加標水平下，米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的平均加標回收率為95.8%～104.0%，相對標準偏差（RSD）為0.769%～3.240%（n=6）。兩種方法簡單、高效、準確，可為米糠脂肪烷醇中高級脂肪烷醇檢測標準的建立提供參考。

關鍵詞：氣相色譜法;二十八烷醇;三十烷醇;高級脂肪烷醇;米糠脂肪烷醇

米糠脂肪烷醇是2017年衛計委發布的一種新食品原料。有研究表明，米糠脂肪烷醇對于在改善身體狀態以及保健等多方面具有良好的功效，目前已被應用于各種功能性食品[1]或保健食品中。

米糠脂肪烷醇主要來源于米糠，是以米糠為原料制得米糠蠟，經皂化、提取、過濾等工藝制成的十二個碳原子以上蠟狀固體的飽和一元醇[2]。其性狀為白色到淺黃色粉末，無味，對光、熱穩定，主要成分為二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇。一般以二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇含量之和計。

目前國內外研究證實，二十八烷醇是一種天然的抗疲勞物質，在增強耐力、精力和體力[3-4];調節運動神經功能[5-6];

增強登高運動機能[7-8];保護肝臟作用[9-10];改善新陳代謝比率[11-13]，降低膽固醇[14]、血脂[15-16]，抗凝血[17]等方面有著明顯的作用。而三十烷醇作為新型的天然植物生長劑，證實不僅對植物生長具有調節和促進作用，還具有明顯的增產效果[18-20]。現國內已有多家利用米糠蠟制備二十八烷醇和三十烷醇的企業，但目前還沒有相對應的國家檢測標準，這導致企業無法向購買者提供檢定證書，影響銷售，同時也造成監管方面存在缺口。

本文采用火焰離子化檢測器檢測，建立了米糠脂肪烷醇中高級脂肪烷醇的氣相色譜外標和內標兩種檢測方法，旨在為國家制定米糠脂肪烷醇中高級脂肪烷醇含量測定和風險監測、評估提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

7890A氣相色譜儀，配火焰離子化檢測器（FID）（美國Agilent公司）;2500TH數控超聲波清洗器（上海安譜實驗科技股份有限公司）。二十八烷醇（純度97.4%，BePure）;三十烷醇（純度98.5%，BePure）;鄰苯二甲酸二葵酯（純度95%，阿拉丁）;甲苯（HPLC級，德國CNW科技公司）;準確稱取20 mg二十八烷醇和三十烷醇標準品（精確至0.01 mg）

于100 mL容量瓶中，用甲苯配制成質量濃度為0.2 mg/mL

的標準混合儲備液，常溫密封保存，備用;確稱取50 mg鄰苯二甲酸二葵酯標準溶液，用甲苯配制成5 mg/mL的內標工作液，冷藏保存。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

外標法：稱取20 mg米糠脂肪烷醇樣品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超聲提取5 min，使其完全溶解，靜置至室溫后用甲苯定容至100 mL，濾液供氣相色譜儀測定。

內標法：稱取20 mg米糠脂肪烷醇樣品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超聲提取5 min，使其完全溶解，靜置至室溫后用甲苯定容至100 mL，取1 mL濾液，加入40 μL內標液，混勻，供氣相色譜儀測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：HP-5柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）;進樣口溫度：300 ℃;檢測器（FID）溫度：320 ℃;程序升溫：初始溫度為200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min;進樣方式：不分流進樣;進樣量：2 μL;載氣：高純氮氣（純度為99.999%）;恒定流速：1 mL/min。二十八烷醇的保留時間為13.426 min，三十烷醇的保留時間為15.722 min。二十八烷醇和三十烷醇的標準溶液色譜圖見圖1。

1.3 計算方法

兩種方法都直接采用標準曲線定量的方式進行計算。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的探討

紅外光譜可以表征羥基（-OH）、末端甲基（-CH3）、次甲基（-CH2）以及（-CH2-）n特有的吸收峰，證明含有飽和碳直鏈的伯醇，但二十八烷醇和三十烷醇是同系物，都有類似的吸收峰，故還需要結合質譜分析，測其分子離子峰，以及主要特征碎片，證明有沒有側鏈，確定其分子量。而二十八烷醇和三十烷醇在紫外光譜中，特征吸收波長分別在198 nm和200 nm處[21]，非常接近，因而采用紫外檢測器對其定量不可行。由于二十八烷醇和三十烷醇的熱穩定性好，因此采用氣相色譜法分析會是最經濟簡便、有效可靠的方法。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

色譜柱的選擇對樣品的分離十分重要，通常不同類型的填料對同一樣品有不同的保留效果。HP-5色譜柱是高性能通用色譜柱，其應用范圍廣，溫度上限高。根據二十八烷醇和三十烷醇的弱極性，以及柱子對高溫的耐受性，采用HP-5色譜柱時，二十八烷醇和三十烷醇能較好的保留和分離，且響應值高。

2.2.2 儀器條件的選擇

二十八烷醇和三十烷醇屬于同系物，在氣相色譜分析中，對于組分沸點范圍窄、化學性質類似的樣品，一般選用一價升溫。另外二十八烷醇和三十烷醇都屬于高沸點物質，實驗發現，在初始溫度為200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min時，兩者可以得到很好的分離。

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取試劑的篩選

米糠脂肪烷醇不溶于水，對酸、堿、還原劑穩定，但能溶于熱乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、環己烷、正己烷、異丙醇、石油醚（60-90）、甲醇、丙酮等有機溶劑。本文重點比較了10種有機試劑對于米糠脂肪烷醇的溶解情況，以及從峰面積比較其提取效果。不同提取溶劑對米糠脂肪烷醇的溶解情況見表1，提取效果見圖2。實驗發現，乙醇、甲醇和丙酮作為溶劑時，米糠脂肪烷醇的溶解效果最差，響應值最低;環己烷、正己烷、異丙醇和石油醚（60-90）作為溶劑時，響應值高，但對于米糠脂肪烷醇的溶解度低，對溫度要求高，溶解后更容易析出;三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷作為溶劑時，米糠脂肪烷醇的溶解速度快，雖然三氯甲烷作為溶劑溶解效果最好，但響應值偏低，二氯甲烷的響應值更低，而甲苯作為溶劑時溶解度比三氯甲烷低，但響應值高。另外根據《中華人民共和國藥典2005版》中溶劑毒性分類，三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷都屬于二類溶劑，但從每日允許接觸量看，毒性：三氯甲烷>二氯甲烷>甲苯。從毒理學資料分析，三氯甲烷屬中等毒性，具有強麻醉性，而且在人體內不能被肝臟代謝，毒性最大;甲苯和二氯甲烷差不多，屬低毒類，但甲苯很不活潑，在人體溫度下不與人體蛋白質、酶、氨基酸等活性物質反應，大部分可在體內被代謝;而二氯甲烷則不同，它是鹵代烴，很容易與人體內蛋白質、酶、氨基酸等發生反應而產生致癌物質。因此，最終確定提取溶劑為甲苯。

2.3.2 提取條件的優化

考慮到米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量各不同，為確定含量對溶解效果的影響，采用甲苯對含量為10%、30%、50%、70%和90%的二十八烷醇和三十烷醇的米糠脂肪烷醇樣品進行提取比較。實驗發現，稱樣量相同的樣品中二十八烷醇和三十烷醇的含量多少對樣品的溶解速度影響不大。根據溫度對樣品的溶解速度的影響，溫度越高，溶解度越大，飽和度越高，為進一步優化提取效果，采用不同溫度、不同超聲時間對不同純度樣品進行提取。研究發現，在水溫30 ℃超聲提取，甲苯對樣品的溶解速度比其在常溫20 ℃超聲提取快，30 ℃超聲提取5 min，樣品完全溶解，相當于20 ℃超聲提取25 min;而30 ℃以上的超聲提取效果都差不多，考慮到超聲提取后要靜置至常溫再定容，所以水溫30 ℃超聲提取較為適宜。另外研究發現，樣品稱樣量越大，在低溫（2～8 ℃）靜置一段時間，溶解后的樣品晶體析出越多，特別是三十烷醇的含量越高，越容易析出，恢復至25 ℃一段時間后會復溶。因此，最終的提取條件定為稱取樣品0.02 g，水浴30 ℃超聲提取5 min。

2.4 線性方程、檢出限和定量限

外標法：配制質量濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL和0.20mg/mL的二十八烷醇和三十烷醇混合標準工作溶液，在選定的色譜條件下進行測定。以目標組分峰面積（y）為縱坐標，以其對應的質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標作線性回歸分析（見表2）。內標法：配制與外標法同樣濃度的混合標準工作液，在1 mL系列濃度中分別加入40 μL鄰苯二甲酸二葵酯內標工作液，以目標組分跟內標物的峰面積比y為縱坐標，以系列濃度（x，mg/mL）為橫坐標作線性回歸分析（見表2）。結果表明，兩種方法中2種目標化合物在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.99。根據1.2.2的色譜條件，將1.1中的標準混合儲備液逐步稀釋濃度，以3倍和10倍信噪比（S/N）為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），二十八烷醇和三十烷醇的檢出限分別為0.07%和0.08%，定量限分別為0.2%和0.25%（見表2）。

2.5 回收率和精密度

向樣品中分別加入基本等量、2倍等量和10倍等量3個水平的二十八烷醇和三十烷醇標準溶液，按所建立的方法進行測定。每份樣品進行6次平行測定，考察方法的回收率和精密度。由表3可知，兩種方法中二十八烷醇和三十烷醇的平均回收率為95.8%～104.0%，相對標準偏差（RSD）為0.769%～3.24%，說明外標法和內標法都具有較好的可靠性。

3 結論

本文建立了高效的氣相色譜外標法和內標法檢測米糠脂肪烷醇中高級脂肪烷醇的含量。外標法更簡便，但對儀器的要求高，內標法可減少儀器誤差，兩種方法都具有簡單高效，靈敏度高，分析速度快的特點。可為國家風險監測、風險評估提供技術支持，為制定米糠脂肪烷醇的檢測標準奠定基礎。

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