副溶血弧菌檢測方法的研究進展

賈晨 王丹 王琪 劉磊 曲連海 周琦

摘 要：本文介紹了副溶血弧菌的傳統檢測方法、免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法等幾種快速的檢測方法，通過對多種檢測方法的優缺點進行分析，為食品行業中副溶血弧菌的檢測方法選擇方面提供理論依據。

關鍵詞：副溶血弧菌;培養法;免疫學檢測;分子生物學檢測

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性嗜鹽性弧菌[1]，常在河口、海底沉積物等海洋環境中，以及魚貝類等海產品中檢出較多[2]。副溶血弧菌不僅嚴重危害海水養殖業，還能引發人類胃腸炎、食物中毒等，是一種條件致病菌[3]。近年來，由于誤食受副溶血弧菌污染或加工不當的海產品而導致的食物中毒事件層出不窮，在我國部分沿海地區，細菌性食物中毒位居首位[4-5]。通過對副溶血弧菌的快速檢測，可以有效防止相關疾病的傳播和發生。近年來，對副溶血弧菌檢測方法的研究取得了較大的進展，本文主要通過對多種檢測方法的優缺點進行分析，為檢測方法的選擇提供理論基礎。

1 培養法

目前，傳統的培養方法是國家標準對于副溶血弧菌的檢測[6]，根據檢測需求，分為定性檢測和定量檢測。取樣品25 g置于3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）中，分別進行定性的增菌和定量的梯度稀釋后，接種到TCBS或弧菌顯色培養基中。挑取可疑菌落，進行生理生化鑒定，如氧化酶試驗、革蘭氏染色鏡檢、三糖鐵試驗、嗜鹽性試驗、生化鑒定、血清學試驗、神奈川試驗等，整體操作時間過長，涉及到的試驗方法以及試劑過多，易造成檢測結果出錯。

1.1 顯色培養基

顯色培養基是近些年逐步應用在檢測行業的傳統培養基代替品，它是一類由目標微生物的代謝產物中的酶，與特異性的酶顯色底物進行反應，顯色酶底物與微生物代謝酶相結合，顯色基團游離進而顯色的原理，檢測目標微生物的新型培養基。與傳統的培養基相比，顯色培養基具有較高的靈敏度和特異性。OLIVIA等[7]使用弧菌的顯色培養基和傳統培養基對于河口不同季節的水樣進行測定，通過對菌株的測序，驗證了傳統培養基對創傷弧菌的假陽性率有2%，霍亂弧菌的假陽性率為19%，而副溶血弧菌的假陽性率達到59%?；【娘@色可以顯著降低假陽性率2～5倍。EDDABRA等[8]對96個糞便和拭子樣本進行測試，通過顯色培養基和TCBS（硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基）對比發現，霍亂弧菌在顯色培養基的檢出率為34%，在TCBS中的檢出率為31%。對霍亂弧菌和副溶血弧菌的特異性進行檢測，顯色培養基的特異性達到100%，而TCBS的特異性只有93.33%。顯色培養基的特異性明顯高于TCBS。

1.2 微生物測試片

微生物測試片是預制型的培養基，采用快速擴散技術、新一代微生物顯色等創新技術，可實現菌落的快速增殖和判讀，提高實驗室的檢測效率。許如蘇等[9]以副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等49株標準菌對測試片的敏感性、特異性和可重復性進行檢測。結果表明，副溶血弧菌在測試片上表現為紫色菌落，其他非目標微生物顯示藍色或者不生長;重復性試驗結果相對偏差偏低，檢測結果良好。但是由于需要考慮實際樣本中的副溶血弧菌的檢測以及樣品的適應性等多種因素干擾，有較高的難度。

2 免疫學檢測方法

免疫學檢測方法主要有酶聯免疫法吸附法、血清型法、免疫熒光技術、免疫擴散技術、免疫膠體金技術和免疫印跡技術等[10]。它們主要的原理是應用抗原和抗體的特異性進行檢測。但是免疫學檢測方法對于抗體的特異性要求較高，同時最低檢出限偏高，導致漏檢的可能性。

2.1 免疫膠體金技術

免疫膠體金技術是采用抗原抗體相結合的原理，以膠體金作為標志物的一種免疫標記技術。朱慧等[11]制備了兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，并對其效價進行測定，提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產物和全菌破碎蛋白，確定4種標記蛋白的濃度，以及抗原蛋白的特異性檢測。檢測結果表明膠體金試紙條準確鑒定出副溶血弧菌，排除其他非目標菌的交叉反應干擾，對人工感染的結果可以進行準確判斷。

2.2 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法簡稱ELISA，是酶聯免疫中應用較廣的免疫測定技術。其原理是抗原或抗體固定在載體表面，在載體表面發生抗原抗體反應，酶與底物發生顯色反應，洗滌后，可通過吸光值進行檢測。ELISA方法可以進行定性或者定量的分析。李國等[12]從瀕死的文蛤中分離鑒定出一株副溶血弧菌，并用該菌苗制備兔抗血清，以HRP-羊抗兔IgG為酶標二抗，對人工感染副溶血弧菌的樣本進行ELISA檢測。結果顯示，采用間接ELISA技術檢測副溶血弧菌，人工污染的文蛤樣本副溶血弧菌的檢出率為80%，健康文蛤樣本的副溶血弧菌檢出率為15%。結果表明ELISA檢測法可以用于發病文蛤的檢測，但還是有假陰性存在。

3 分子生物學檢測方法

3.1 PCR方法

隨著分子生物學的飛速發展，PCR的方法已經被逐漸的寫入標準中。PCR方法（Polymerase chain reaction，PCR），又稱聚合酶鏈式反應，是一種通過溫度控制可實現體外擴增特異DNA片段的技術。PCR檢測具有靈敏度高、特異性強等優勢。KIM等[13]基于toxR基因的PCR方法檢測副溶血弧菌，采用28個目標和非目標菌株建立了PCR檢測方法，通過494株菌株檢測目標菌株的特異性。結果75.5%的副溶血弧菌較強的特異性，非目標菌株沒有得到擴增。PCR檢測方法雖然靈敏度較高，但是過于依賴目標基因的分離和富集，且易受到程序設置的干擾。

3.2 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、重復性好、準確性高等優點。王建昌等[14]根據已知的副溶血弧菌基因組序列，篩選特異性靶基因，設計特異性引物探針，優化反應體系，并在體系內加入內參（IAC），通過標記不同熒光基團的Taqman探針來監測IAC，進而實時監控整個PCR反應。建立gyrB-IAC相關標準曲線，Ct值與拷貝數有良好的線性關系;人工污染的初始菌量為7 cfu/25 g，樣品增菌6 h后，副溶血弧菌即可檢出。胡興娟等[15]針對副溶血性弧菌tlh基因，沙門菌Ompc基因和單增李斯特菌hly基因設計引物和TaqMan探針，建立3種致病菌的多重熒光定量PCR檢測體系，并對海產品中的副溶血性弧菌、沙門菌和單增李斯特菌的進行檢測。結果3種目標致病菌均可得到特異性擴增，而其他非目標細菌均未見特異性擴增曲線。該體系對副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的最低檢測限均小于

100 cfu/mL。并對150粉實際樣本進行檢測，與國家標準法檢出率一致。

3.3 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴增方法，其特點是在鏈置換特異的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，設計4種特異引物，進行60～65 ℃恒溫擴增，15～60 min即可實現核酸擴增，具有操作簡單、特異性強等特點。反應過程中加入染料等，在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出產生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現白色。因此，只需肉眼觀察產物中的濁度即可，操作過程簡單，結果易判讀。胡元慶等[16]用tlh基因作為副溶血弧菌的靶向基因，設計了4條引物，優化LAMP檢測方法中的反應體系和反應條件。體系用Bst DNA聚合酶催化，恒溫反應60 min，產物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳和SYBR Green I染色鑒定，對各項反應參數進行優化;將菌液的10倍稀釋液進行LAMP和PCR反應，并對32株食源性病原菌進行LAMP擴增，驗證其特異性;結果顯示，確定25 μL體系中Mg2+濃度為3.6 mmol/L，dNTPs濃度為0.96 mmol/L，聚合酶用量為4.8 U，內外引物濃度比為8∶1，最佳反應溫度為63 ℃，時間為60 min;LAMP的最低檢測限明顯低于PCR檢出限;對32個菌株進行特異性檢測，陽性率為100%，說明LAMP具有較高的特異性。

3.4 重組酶聚合酶等溫擴增技術

重組酶聚合酶等溫擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是可以替代傳統PCR的核酸檢測技術，是新一代的等溫擴增核酸檢測技術。RPA技術基于重組酶聚合酶，且最佳反應溫度在20～37 ℃，20 min內完成擴增反應。劉小青等[17]采用RPA技術，建立了以irgB為靶基因的RPA-exo副溶血弧菌的引物探針，對引物探針進行組合篩選，建立RPA-exo熒光探針快速檢測方法，

15 min可完成檢測，具有高特異性，無交叉反應，靈敏度較高;人工污染樣品加入終濃度為1.36×103 CFU/mL時，無需增菌即可被檢出;實際樣品檢測檢測結果與GB 4789.7—2013結果一致。

4 結語

副溶血弧菌的檢測方法各有優缺點。傳統國家標準檢測方法要經過培養基的基礎培養，挑取可疑菌落分離、增菌、鏡檢和生化鑒定等煩瑣步驟;顯色培養基和微生物測試片使用方便，但需要具有特異性較高的酶底物。免疫學檢測方法對于抗體的特異性要求較高，同時最低檢出限偏高，導致漏檢的可能性。分子生物學檢測方法具有靈敏度高、重復性好、反應高效、準確性高等優勢，但是過于依賴目標基因的分離和富集，且容易受到程序設置的干擾。

食品中副溶血弧菌檢測方法有傳統檢測方法、實時熒光定量PCR、LAMP、RPA 和MPCR-DHPLC法等，并可以多種結合進行目標菌株鑒定。多種檢測方法相結合，融合多種優勢，如LAMP技術與生物傳感器技術相結合，酶聯免疫磁珠技術與PCR技術相結合，MALDI-TOF MS與16S rRNA鑒定相結合。基因芯片技術融合了PCR、納米芯片和探針雜交。

上述針對副溶血弧菌的相關檢測方法，無論是從科學調查角度還是食品安全角度來說，對副溶血弧菌的有效檢測都存在著重要的研究意義。這些方法存在著一些不可忽視的問題，應當綜合考慮各檢測方法優劣勢，在多項技術的基礎上建立可以滿足多方面需求的快速、高效、經濟的檢測方法，才能實現副溶血弧菌的有效檢測，保障食品安全。

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