板栗殼黃酮類成分的提取工藝研究

張琳琳 呂華瑛 王琳 石亮 李克明

摘 要：為了優化板栗殼中的黃酮類成分的提取工藝，分別采用不同溶劑、不同提取方式浸提板栗殼中的黃酮成分，并選取提取次數、加醇量（料液比）、提取時間、醇濃度作為考察因素，設計正交實驗對提取工藝進行優化，以蘆丁為標準品，硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，用可見-紫外分光光度計檢測提取物中總黃酮的含量，比較總黃酮提取物的收得率，優選最佳提取工藝。結果表明，當選用60%乙醇回流提取，提取2次，加醇量為10倍量，提取時間為1.5 h時板栗殼總黃酮提取率最高，平均提取率為19.36%。

關鍵詞：板栗殼;黃酮;提取工藝

板栗殼為殼斗科植物板栗（Castanea mollissima Bl.）的干燥外果皮，除青海、新疆以外，在遼寧以南各省（市、區）均有栽培，作為中藥收載于《中華人民共和國藥典 四部》（2015年版）中[1]，其藥性甘、澀、平，具有降逆化痰、清熱散結、止血之功效，常用于治療反胃、消渴、咳痰、瘰疬、衄血、便血及腮腺炎等。

板栗殼為板栗的帶刺毛殼，即板栗總苞。歷代“本草”對其稱呼不同，《證類本草》中稱其為“栗毛殼”，《滇南本草》中稱其為“子上殼刺”，《本草綱目》《中華本草》《中藥大辭典》中均稱其為“栗毛球”，江西《草藥手冊》中稱其為“板栗殼斗”，《中國藥典》中稱其為“板栗殼”，至今，各名稱均有不同程度沿用。

近年研究表明，板栗殼含有豐富的黃酮、多糖、酚類等成分[2-4]，文獻報道栗殼中含有豐富的天然棕色素，屬于黃酮類，不僅可廣泛用于食品、日用化學品和藥品的著色劑，現代藥理研究還顯示栗殼黃酮具有抗菌、抗氧化、自由基清除等多方面作用[5-7]，故本課題系統研究并優化板栗殼中黃酮類成分的提取工藝，為其工業化規模生產提供依據。

1 儀器與試劑

板栗，濟南市售。

電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）;FA 2004分析天平（上海第二分析儀器廠）;TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;KQE-400B型超聲清洗機（濟南巴克超聲波科技有限公司）;KFS-C2電子天平（凱豐集團）。

無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、蘆丁標準品。

2 方法與結果

2.1 黃酮成分測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，以蘆丁為標準品繪制標準曲線。準確吸取蘆丁標準溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL（相當于蘆丁0 μg、75 μg、150 μg、300 μg、450 μg和600 μg），加蒸餾水補足至2 mL，各加入30%乙醇溶液4 mL和5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以吸光度A為縱坐標、蘆丁含量C（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得到曲線方程為A=11.67C-0.016 6，相關系數R2=0.999 1，蘆丁溶液的濃度在0.017～0.104 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

樣品測定。取2 mL樣品按照標準曲線繪制的操作步驟進行檢測，同樣于510 nm處進行吸光度的測定。

2.2 工藝流程

將板栗殼洗凈后放于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40目篩，精密稱取栗殼粉樣品2 g，加入一定體積的溶劑，在相應溫度水浴和浸提時間內浸提，浸提液經5 000 r/min離心15 min，取上清液，定容至40 mL，放置于4 ℃冰箱中貯存備用。

2.3 不同溶劑浸提產率

分別采用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯為溶劑浸提板栗殼中的黃酮成分，將提取成分純化后用超純水定容至100 mL作為供試品試液，按照2.1的方法，測定吸光度，根據標準曲線的回歸方程得出不同浸提液中黃酮的濃度，根據公式（1）計算黃酮得率。

（1）

式（1）中，W為總黃酮產率，%，C為測定總黃酮的濃度，mg/mL，D為稀釋倍數，V為供試液的體積，mL，M為板栗殼的質量，g。

不同溶劑浸提板栗殼總黃酮產率見表1。從表1可以看出，乙醇作為溶劑提取黃酮的產率最高。

2.4 不同濃度乙醇提取黃酮產率

精確稱取板栗殼粉樣品2.00 g共18份，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入25 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%的乙醇溶液，每個處理重復3次。各組樣品均在室溫下浸泡24 h，之后減壓、抽濾，濾液放置于旋轉蒸發儀上減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下。將蒸干的樣品稱重，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至刻度，搖勻后測定，按公式（1）計算黃酮產率。實驗結果見表2，從表2可以看出，55%乙醇提取的黃酮產率最高。

2.5 不同提取方法提取黃酮產率

（1）回流提取法。精確稱取板栗殼粉樣品2.00 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入25.0 mL的55%乙醇溶液，浸泡20 min后加熱回流提取30 min，放冷，減壓抽濾，濾液放置于旋轉蒸發儀中減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉移至25 mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，測定黃酮產率。平行測定4份，計算平均產率。

（2）超聲提取法。精確稱取板栗殼粉樣品2.00 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡20 min后在超聲波清洗儀上室溫超聲30 min，超聲完畢后減壓抽濾，濾液放置于旋轉蒸發儀中減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下，向干浸膏中加入適量30%乙醇超聲溶解，轉移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，測定黃酮產率。平行測定4份，計算平均產率。

（3）微波輔助提取法。精確稱取板栗殼粉樣品2.00 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入25.0 mL 55%的乙醇，浸泡55 min（保證樣品與浸提溶劑接觸的總時間與其他方法一致），再用微波中火提取5 min（提取中每隔1～2 min停30 s），放冷，減壓抽濾，濾液放置于旋轉蒸發儀中減壓蒸干，溫度控制在60 ℃以下，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉移至25 ml量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，測定黃酮產率。平行測定4份，計算平均產率。

實驗結果見表3，由表3可以看出，55%乙醇回流提取的黃酮產率最高。

2.6 正交設計

影響板栗殼總黃酮含量的因素主要有提取次數、加醇量（倍量）、提取時間、醇濃度，故以這4個影響因素的3個水平，采用L9（34）正交表設計進行實驗，考察板栗殼中總黃酮的含量，結果見表4和表5。

由表5的正交試驗數據結果可以看出，影響總黃酮含量提取的4個因素按順序為D>B>C>A，即提取醇濃度>加醇量>提取時間>提取次數。通過4因素3水平的考察，得出最佳提取條件為A1B3C3D3，即提取1次，加醇量為10倍量，提取時間1.5 h，提取醇濃度60%時，所得板栗殼總黃酮含量最高，為19.21%。通過方差分析表6可見，因素D、B、C對試驗結果有顯著性影響，綜合分析實驗條件后選擇A2B3C3D3為最佳提取條件，即采用60%醇提取法，提取2次，加醇量為10倍量，提取時間1.5 h。在以上工藝優選條件下重復實驗3次，平均提取率為19.36%。

3 討論

板栗營養價值豐富，口感美味，受到廣大人民的喜愛，在全國栽培廣泛，但板栗殼目前大多被當作廢棄物丟棄，造成了資源的浪費，主要原因是人們并未意識到板栗殼的價值所在，對板栗殼的開發利用也未普及推廣。黨的十八大提出了建設環境友好型、資源節約型社會的要求，加強板栗殼的開發利用也正是響應國家號召的一大舉措。

本文通過前期對板栗殼的藥理作用的文獻查閱，發現越來越多的科研人員開始重視板栗殼的重大開發價值，對板栗殼的研究也越來越多，通過研究人們發現了板栗殼具有的許多藥理作用，包括抗菌抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖降血脂和改善腦缺血等人們非常關注的一些作用，當然具體的臨床應用還需要進一步的研究。

在本實驗研究中通過對不同溶劑浸提板栗殼中的黃酮成分，比較總黃酮提取物的收得率，優選最佳提取溶劑為55%乙醇提取;通過不同提取方式的研究確定了最佳提取方式為55%乙醇回流提取;通過對影響實驗的4個因素3個水平的正交試驗最終確定了最佳提取工藝為選用60%的乙醇回流提取，加醇量為10倍量，提取次數為2次，提取時間為1.5 h，此時板栗殼總黃酮提取率最高，為19.36%。本研究為工業化規模生產及促進栗殼的臨床藥用提供了理論依據。

參考文獻

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