一種氯霉素高靈敏消線法檢測試紙條的制備

寧軍 李娜 嚴雨倩 付麟 周興華

摘 要：本文對氯霉素進行丁二酸酐衍生得到半抗原，將半抗原與載體蛋白BSA偶聯作為免疫原，氯霉素與偶連載體蛋白OVA作為篩選抗原，獲得氯霉素單克隆抗體，IC50值為0.010 6 ng/mL，線性范圍為0.002 3～0.049 5 ng/mL，特異性好，與相關藥物沒有交叉。在此抗原抗體的基礎上制備膠體金試紙條，對雞肉樣本進行添加回收試驗，消線法檢測限為0.1 ?g/kg，與目前市場上主流的比色法判讀試紙條相比，消線法判讀更加快速，不需要使用讀數儀輔助判讀，為農產品質量安全提供有力保障。

關鍵詞：氯霉素;單克隆抗體;膠體金免疫層析試紙條;消線法;檢測

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用。長期食用含有氯霉素的雞肉組織會擾亂人體正常的生理功能，引起再生障礙性貧血。農業部第250號公告中明確規定氯霉素及其鹽、酯在動物性食品中禁止使用，所以測定動物組織中氯霉素殘留含量具有重要的意義。目前動物性食品中氯霉素殘留檢測方法有免疫分析方法、質譜法等。免疫學方法是農產品中抗生素殘留檢測中最重要的檢測技術之一，具有成本低、操作簡便、快速等優點，不需要輔助儀器，更適合大量樣本的初篩檢測。目前市場上的氯霉素試紙條，靈敏度不夠高，基本上都是采用比色判讀方法，試紙條上控制線和檢測線差異不大，判讀結果爭議較大。本研究制備的氯霉素試紙條，靈敏度高，可以采用消線法判讀，判讀更加快速、準確，為農產品質量安全提供有力保障[1-5]。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

氯霉素標準品，購買自百靈威科技有限公司;牛血清白蛋白（BSA）、水溶性碳二亞胺鹽酸鹽（EDC HCL）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（TMB）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇溶液（50% PEG solution（w/v））、辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗、羊抗鼠抗體IgG購買自武漢博士德公司;新西蘭胎牛血清，細胞基礎培養液RPMI 1640，選擇性培養基HAT（50×）、HT（100×），購買自Gibco公司;膠體金試紙條底板（PVC材質），硝酸纖維素膜（NC膜），吸水墊和樣品墊均購買自Goldbio科技有限公司;其他實驗室常用試劑均為國產分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司;陰性雞肉樣本由溫氏集團檢測中心提供。

1.2 儀器與設備

臺式高速（冷凍）離心機，湘儀儀器;高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-375 1L-PC），松下健康醫療器械株式會社;磁力攪拌器（Big Squid），德國IKA;純水機（20 TB），賽飛（中國）有限公司;液氮罐，成都金鳳液氮容器有限公司;酶標儀、3111型加水套CO2培養箱、紫外-可見分光光度計Biomate 3S，Thermo Fisher Sciencetific公司;潔凈工作臺（BCM-1300A），蘇凈安泰空氣技術有限公司;數顯恒溫水浴鍋（HH-2），江蘇金怡儀器科技有限公司;倒置顯微鏡（XD-202），南京江南永新光學有限公司;金標滑膜儀、切條機，上海金標生物科技有限公司。

1.3 實驗動物和細胞

實驗動物：SPF級BALB/c小鼠，6～8周齡，雌性，揚州大學醫學中心;實驗細胞：SP 2/0細胞，中國科學院上海生命科學研究院。

1.4 試驗方法

1.4.1 半抗原衍生

氯霉素分子表面有兩個自由羥基，一個伯羥基，一個仲羥基。伯羥基可以與丁二酸酐反應生成羧酸，可與蛋白偶連。5.5 mg氯霉素溶解于0.5 mL吡啶中，加入4.2 mg DMAP與2 mg丁二酸酐，50 ℃磁力攪拌反應4 h，得到衍生產物CAP-COOH。將反應產物氮吹干，溶解于水中并使用二氯甲烷萃取2次，將二氯甲烷相合并，氮氣吹干，得到目標產物[6-7]。衍生步驟如圖1所示。

1.4.2 完全抗原的合成

（1）免疫原合成方法。2 mg的CAP-COOH半抗原溶解于400 ?L DMF溶液中，加入1.1 mg NHS與1.8 mg碳二亞胺EDC，室溫條件下磁力攪拌反應2 h，得到活性酯。隨后將活性酯逐滴加到5 mg BSA溶液中，室溫磁力攪拌過夜。將最終產物裝入透析袋中，在0.05 mol/L PBS溶液中透析

3 d，每4～8 h更換一次透析液。透析結束后分裝小份，

-20 ℃保存[8-10]。

（2）包被原合成方法。氯霉素上游離的羥基通過CDI法與蛋白偶聯，3 mg CAP溶解于0.5 mL無水DMSO試劑中，加入2 mg CDI，室溫磁力攪拌反應20 min。向反應液中加入100 ?L超純水終止反應。隨后將活化產物逐滴加到5 mg OVA蛋白溶液，室溫條件下磁力攪拌反應4 h。偶聯產物在0.05 mol/L PBS溶液中透析3 d，每4～8 h更換一次透析液[11]。透析結束后分裝小份，-20 ℃保存。

1.4.3 小鼠免疫及血清篩選

使用合成的完全抗原CAP-COOH-EDC-BSA作為免疫原進行小鼠免疫實驗，CAP-CDI-OVA作為包被原進行篩選實驗。每個免疫原選取4只BALB/c小鼠進行免疫。采用間接競爭ELISA方法[12-13]測定小鼠血清效價與抑制效果，具體步驟如下。

（1）包板。用包被緩沖液將包被原（CAP-CDI-OVA）稀釋到適宜濃 度，加入到96孔酶標板（100 ?L/孔）中，37 ℃下孵育2 h。孵育結束后甩出酶標板中液體，加入洗滌緩沖液（含0.05% 吐溫 20的0.01 mol/L PBS，200 ?L/孔），靜止3 min后甩出，拍干，重復洗滌3次，拍干。

（2）封閉。每孔中加入200 ?L封閉液，4 ℃過夜，洗滌液改為250 ?L洗滌3次，拍干。

（3）一抗。使用棋盤法同時測定小鼠的血清效價與抑制。使用洗滌緩沖液作為陰性對照（50 ?L/孔），檢測組加入適宜濃度的標準品溶液（50 ?L/孔）。處理好的小鼠血清從

1 000倍用抗體稀釋液進行梯度稀釋（1 000、3 000、9 000、27 000倍），分別對應加入對照組與檢測組中，37 ℃下孵育30 min，洗滌3次同上，拍干。

（4）二抗。將HRP二抗用洗滌緩沖液稀釋3 000倍，然后每孔加入100 ?L，37 ℃下反應30 min，洗滌3次同上，拍干。

（5）顯色。使用前將A液與B液按1∶1配制，混勻后加入酶標板（100 ?L/孔），37 ℃下避光顯色15 min。

（6）終止。酶標板中每孔加入50 ?L終止液，使用酶標儀測量450 nm、620 nm下吸光值，最終結果按照OD450 nm-OD620 nm保存數據。

1.4.4 細胞融合及抗體制備

篩選效果較好的小鼠進行細胞融合試驗。①SP 2/0細胞的復蘇與擴大培養;②小鼠脾臟細胞融合。小鼠脾細胞與SP 2/0細胞混合均勻，比例為5∶1，采用PEG 1500進行細胞融合試驗;③雜交瘤細胞的培養與篩選。細胞融合后第7 d進行細胞上清檢測，挑選OD值高，抑制率高的孔進行亞克隆，使用有限稀釋法進行3次亞克隆，挑選出單團雜交瘤細胞轉移至培養瓶中進行擴大培養，最后轉移至液氮儲存箱中保存[8]。

采取體內誘生腹水瘤法制備細胞株腹水抗體，再使用辛酸-硫酸銨法進行抗體純化[11]。

1.4.5 單克隆抗體的評價

采用間接競爭法，分別測定所制備單克隆抗體對氯霉素與其結構類似物（氟苯尼考、甲砜霉素）的IC50值。交叉反應率（Cross-reactivity，CR，%）=（氯霉素IC50值/類似物IC50值）×100%[6，13]。

1.4.6 膠體金試紙條的制備

按照檸檬酸三鈉還原法制備金納米粒子，采用0.1mol/L碳酸鉀溶液進行抗體標記，標記量分別為6 ?g/mL、8 ?g/mL、10 ?g/mL和12 ?g/mL，10% BSA封閉，0.01 mol/L pH 8.5硼酸緩沖液（含0.25% BSA，3%海藻糖，1%吐溫20）復溶，按照50 ?L每孔加入到微孔板中，凍干，密封保存。

試紙條主要由PVC底板，NC膜，樣品墊和吸水紙組成。將羊抗鼠抗體（靠吸水紙端）和抗原（靠樣品墊端）按照一定的濃度劃到硝酸纖維膜上，分別構成試紙條質控線（C線）和檢測線（T線），隨后將試紙條在37 ℃下烘箱中烘干過夜[14-16]。

在靠近C端貼上吸水紙，靠近T線端貼好樣品墊。切成4 mm寬度。檢測時，將待檢測液體加入微孔中，反應3 min后，插入試紙條，5 min后判讀。

1.4.7 添加回收試驗

對雞肉陰性樣本進行氯霉素添加回收試驗。陰性對照組添加不含標準品空白溶劑作為對照。具體操作如下：取4 g均質后的樣品，添標濃度分別為0、0.05 ?g/kg、0.10 ?g/kg和0.20 ?g/kg，加入7 mL乙酸乙酯，劇烈振蕩5 min，4 000轉離心5 min。取4 mL上清，氮氣65 ℃吹干后，再加入2 mL正己烷和0.4 mL 0.01 mol/L PBS，振蕩1 min，離心3 min，去除上層，取下層溶液100 μL點樣。

2 結果與分析

2.1 完全抗原的合成與表征

氯霉素半抗原、載體蛋白（BSA和OVA）及合成的免疫抗原和包被抗原分別使用0.01 mol/L PBS稀釋至合適的濃度，使用紫外-可見分光光度計在200～450 nm范圍內進行掃描，結果如圖2所示。

如圖2所示，兩種載體蛋白的紫外特征峰均位于278 nm左右，偶聯物CAP-COOH-EDC-BSA紫外吸收較同濃度的BSA有明顯增強且有略微偏移。同樣，偶聯物CAP-CDI-OVA紫外吸收較同濃度OVA也有明顯增強，紫外表征結果顯示氯霉素半抗原成功的與載體蛋白進行了偶聯。

2.2 單克隆抗體的評價

通過對小鼠血清進行ELISA檢測，篩選效價高、抑制率高的小鼠進行細胞融合實驗。通過陽性篩選與3次亞克隆，得到針對氯霉素的雜交瘤細胞株（6 E2），并制取腹水，純化后得到氯霉素單克隆抗體[11]。

采用棋盤法，篩選出氯霉素單克隆抗體的最佳工作點，即包被濃度0.03 ?g/mL、抗體濃度0.25 ?g/mL，然后以不同濃度的氯霉素標準品溶液（0、0.003 ng/mL、0.010 ng/mL、0.030 ng/mL、0.090 ng/mL和0.270 ng/mL）建立標準曲線，其標準曲線如圖3所示，其IC50值為0.010 6 ng/mL，線性范圍（IC20～IC80）為0.002 3～0.049 5 ng/mL，相關系數為0.999 0。

通過ic-ELISA方法測定氯霉素單克隆抗體的交叉反應，檢測結果如表1所示，氯霉素單克隆抗體具有特異性，對氟苯尼考和甲砜霉素交叉均在1%以下。

2.3 膠體金試紙條的制備

使用不同包被濃度和抗體標記量進行試驗，確定最優條件C線劃膜濃度為0.5 mg/mL、T線劃膜濃度為0.2 mg/mL和抗體標記量為10 ?g/mL。如圖4所示，使用肉眼觀察時，氯霉素金標試紙條消線值為0.1 ?g/kg。

2.4 實際樣本添加回收試驗

采用以上前處理方法，使用陰性樣品添加試驗確定該方法靈敏度。4種陰性雞肉樣品氯霉素添加水平為0、0.05 ?g/kg、0.10 ?g/kg、0.20 ?g/kg。結果如圖5所示，使用肉眼觀察時，氯霉素消線法的檢測限為0.1 ?g/kg。

3 結論

本文采用一種完全抗原對小鼠進行免疫，成功制備了一種氯霉素單克隆抗體，IC50值為0.010 6 ng/mL，特異性好，與相關藥物沒有交叉。在此抗原抗體的基礎上制備膠體金試紙條，對雞肉組織樣本做了添加回收試驗，消線法檢測限為0.1 ?g/kg，該方法成本低、靈敏度好、操作方便快速，判讀方式簡單，對雞肉中氯霉素殘留的監控有重要意義。

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