典型紅壤水稻土剖面細菌和真菌分子生態網絡特征研究*

黃蘭婷，倪浩為，李新宇，孫 波，梁玉婷?

（1.常州大學環境與安全工程學院，江蘇常州 213164；2.土壤與農業可持續發展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京210008；3.污染生態與環境工程重點實驗室（中國科學院應用生態研究所），沈陽 110164）

土壤具有高度的空間異質性，復雜的土壤孔隙結構為微生物提供了適合的生存空間，不同的微環境會影響微生物的豐富度[1]，土壤理化性質沿土壤深度的變化會影響微生物的群落結構及互作。Bahram等[2]研究表明環境因素和微生物之間的競爭關系均會影響微生物群落的結構、組成和功能基因的豐度。深層土壤可能含有與表層土壤不同的且適應深層土壤環境的微生物群落[3-4]，從而表現出不同的生態功能[5-6]。目前對于土壤微生物的研究大多數集中在0～20 cm的表層土壤上，對更深層土壤微生物群落空間變化的研究較少[7]，對農業系統中土壤微生物群落隨土壤深度變化的研究更少[8-9]。研究表明深層土壤微生物在土壤的形成、生物地球化學循環過程和污染物降解等方面發揮著重要的作用[10]。通過水分循環，深層土壤與表層土壤之間物質的流動和交換還會顯著影響表層土壤質量從而影響表層植被的生產力[11]。土壤深度的增加會導致土壤微生物量和多樣性的減少。Du等[12]發現由于土壤養分含量的不同導致微生物數量和香農指數均隨深度而下降，且每層土壤中都含有特定的OTU（Operational taxonomic units）。Li 等[13]通過使用磷脂脂肪酸分析方法（phospholipid fatty acid，PLFA）研究稻田土壤中微生物群落隨土壤深度的變化，表明土壤深度的增加，顯著減少了土壤微生物的生物量和多樣性，該結果意味著土壤含水量和養分含量是不同深度土壤微生物變化的主要驅動因子。土壤深度的增加還可能影響微生物的群落結構。Li等[14]的研究結果表明水稻土中細菌群落組成差異隨深度的增加而變大，其中土壤全碳含量（Total carbon，TC）和全氮含量（Total nitrogen，TN）是導致水稻土細菌群落結構變化的主要影響因素。此外，土壤深度的增加還可能影響微生物的群落功能。Wang 等[15]通過研究土壤氮循環相關基因與土壤深度之間的關系，表明除amoA-AOA 基因外，其他氮循環相關功能基因豐度均隨土壤深度的增加而顯著降低，且這些基因與土壤碳、氮和碳氮比呈顯著正相關。

過去對微生物的研究大多集中在物種數量和多樣性上，而不是物種間的相互作用。然而在復雜的生態系統中，物種間的相互作用對生態系統的功能可能較物種豐富度和多樣性更為重要[16-17]。微生物之間的相互作用是陸地生態系統中微生物群落互作網絡的組成部分[18-19]。利用生態網絡分析法（Ecological network analysis）可以揭示微生物潛在的互作機制及影響因素[20]，是預測和改善土壤生態系統功能的重要步驟[21]。王丹丹等[22]使用生態網絡分析法研究生物炭的添加對土壤根際真菌群落相互作用的影響。Purahong等[23]使用生態網絡的分析方法研究了凋落物分解過程中細菌和真菌群落的交互作用模式，證明微生物群落變化和相互作用驅動了凋落物分解的不同階段。

為揭示典型紅壤水稻土剖面微生物分子生態網絡特征，本研究選擇江西鷹潭典型紅壤水稻土作為實驗對象，采集0～100 cm的5個剖面土壤，研究上層（0～20 cm），中層（20～60 cm）和下層（60～100 cm）不同深度紅壤細菌和真菌的互作關系特征。通過對細菌16S rRNA和真菌18S rRNA的高通量測序，在前期研究的基礎上[13-15]，利用生態網絡分析法構建三了個不同深度土壤微生物群落互作網絡，以揭示紅壤剖面不同深度微生物的界內及界間互作關系，并且利用隨機森林和VPA兩種分析方法探討了影響微生物互作關系的環境因素。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采集于江西鷹潭地區（116°54′–116°56′E，28°10′–28°13′N，海拔 34～62 m）晚稻收獲后期（2014年10月至11月）。在該地區隨機選擇5個地點（每個地點相距至少3 km）采集5個重復樣品，這些地點均具有土壤類型、耕作制度和氣候條件等變量變化較小的特點。在每個地點，使用螺旋鉆按照以下深度間隔（cm）垂直采集土壤樣本：0～10、10～20、20～40、40～60、60～80 和 80～100，共30個樣本[14]。

1.2 土壤理化性質的測定

土壤含水率使用重量法測定。可溶性有機碳（Dissolved organic carbon，DOC）使用Multi N/C 3100分析儀（Analytitik Jena AG，Jena，Germany）測定。-N和-N使用AA3 Continuous Flow Analyzer分析儀（Seal Analytic，Germany）測定。土壤全碳和全氮使用vario MICRO cube（Elementar Corporation，Germany）測定。

1.3 DNA提取及高通量測序

使用FastDNA SPIK Kit土壤旋轉試劑盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）從0.5 g凍干土中提取土壤脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和納米滴分光光度計（NanoDrop，Wimmington，DE，USA），測定DNA的質量和濃度。測定合格的30個樣品的DNA在–20℃下儲存。

細菌 16S rRNA的擴增引物序列是 Bacteria-341F=5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，Bacteria-758R=5′-CTACCAGGGTATCTAATCC-3′。PCR 擴增的條件為：變性95 ℃、10 s ，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、45 s，重復循環變性-退火-延伸45次。真菌18S rRNA的擴增引物序列是Fungal-FR1=5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3 ′，Fungal-FR390=5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′。PCR擴增的條件為：變性95 ℃、10 s，退火50 ℃、30 s，延伸72℃、45 s，重復循環變性-退火-延伸45次。

1.4 數據處理

根據測序得到的細菌和真菌的OTU數據，使用Cytoscape軟件中的 CoNet插件構建微生物生態網絡。分析步驟和網絡參數的選擇參考顧靜馨[24]。網絡分析中選擇四種相關分析方法，即 Pearson correlation，Spearman correlation，Bray-Curtis dissimilarity和 Kullback-Leibler dissimilarity，起始連接數設置為500。然后，采用Benjamini-Hochberg方法標準化處理相關系數，即校正原有假設檢驗得到的顯著性P值（P-value），并最終采用校正后的P值，保留P<0.05的相關OTU構建關聯網絡。利用NetworkAnalyzer工具，獲得網絡的特征路徑長度、連接數、節點數、群聚系數、網絡密度和平均連通度等網絡拓撲參數。

本研究通過 R軟件的“vegan”數據包計算樣品的豐富度和多樣性。隨機森林的分析方法是通過對數據集中的每一個解釋變量分別隨機置換以得到每個解釋變量對被解釋變量的貢獻程度，以均方誤差（mean square error，MSE）表示。本研究利用R 軟件中的“randomForest”數據包進行隨機森林模型的預測；對模型整體的檢驗利用“rfUtilities”數據包；隨機森林中每個變量對模型貢獻程度的顯著性檢驗利用“rfPermute”數據包。方差分解分析（Variance Partitioning Analysis，VPA）是一種偏分析法，能夠揭示不同環境因子對細菌真菌互作關系的相對貢獻率大小，本研究使用R軟件中的‘vegan’數據包完成。

2 結 果

2.1 土壤理化性質沿深度的變化

隨著土壤深度的增加，土壤理化性質如pH、含水率（Soil moisture，SM）、TN、TC和碳氮比（C/N）等均顯著變化（圖1）。例如，土壤pH先增加后減小，在40～60 cm之間土壤的pH最大；與之相反，-N先減小后增加。此外，除DOC和-N的含量隨深度的增加而增加外，TC、TN和C/N均隨土壤深度的增加而減小。

2.2 紅壤剖面微生物的群落豐富度指數

沿土壤剖面計算了細菌和真菌群落的豐富度指數（圖2）。結果表明，盡管細菌和真菌的豐富度指數沿土壤深度的增加有相同的響應模式。但是相比于真菌，細菌豐富度對土壤深度的響應更加敏感。例如：細菌群落的豐富度指數隨深度增加連續降低（P<0.05）；而真菌群落在60～100 cm深度范圍內的豐富度并不隨土壤深度的進一步增加而降低。該結果表明了相比于細菌而言，真菌群落對資源限制可能有更強的抵抗力。

2.3 紅壤剖面微生物網絡互作關系

基于紅壤剖面細菌真菌豐富度指數的變化（圖2）及群落結構分布[14]，本研究將0～100 cm土壤劃分為上層（0～20 cm）、中層（20～60 cm）和下層（60～100 cm）。基于顯著相關性對細菌和真菌的高通量測序數據構建互作網絡（圖3），探究細菌-真菌群落的共現模式，使用 NetworkAnalyzer工具計算網絡的拓撲參數（表1）。網絡拓撲參數的分析表明，隨著土壤深度的增加，網絡的群聚系數、平均鄰居數和網絡密度均顯著增加，特征路徑長度和網絡節點數則顯著減小。該結果表明土壤微生物之間的總網絡互作隨深度的增加而變得復雜緊密。

表1 三個不同深度下微生物互作網絡拓撲性質Table 1 Topological properties of microbial interactions network relative to soil depth

上中下三層土壤微生物互作網絡圖顯示（圖3a），土壤微生物互作網絡的模塊化隨深度增加，細菌、真菌群落界內的相互作用增加，其中細菌以正相互作用為主，真菌以負相互作用為主。上中下三層土壤微生物互作網絡在門水平的弦圖（圖3b）表明，細菌群落界內互作主要為酸桿菌門和綠彎菌門，真菌群落界內互作主要為子囊菌門和擔子菌門。在上層網絡中，細菌-真菌群落界間的互作復雜，包含多個細菌門類與真菌門類的互作；中層網絡中，細菌-真菌群落界間的互作包含的門類減少，主要是酸桿菌門與子囊菌門之間的互作，綠彎菌門與子囊菌門之間的互作；下層網絡中，細菌-真菌群落界間的相互作用進一步減少，細菌與真菌群落界內的相互作用增加，如酸桿菌門和子囊菌門的自相互作用增加。

進一步分析微生物界內和界間互作所占比例，細菌在互作網絡中的占比隨深度的增加而減少，真菌在互作網絡中的占比增加；細菌、真菌群落界內互作與深度成正比。

不同深度紅壤互作網絡中群落之間連接數的分布情況顯示（圖4），上層土壤的細菌、真菌群落界內互作和細菌-真菌群落界間互作分別占上層網絡的 37%、34%和29%，且均以正相互作用為主。中層土壤網絡中以細菌群落界內正相互作用為主。下層土壤網絡中以真菌群落界內負相互作用為主。研究結果進一步表明土壤中細菌-真菌群落界間互作與深度成反比，且細菌-真菌群落界間互作的正連接數占總連接數的占比隨深度的增加顯著減少（上層：18%，中層：6%，下層：3%）。

2.4 紅壤剖面微生物互作網絡的影響因素

利用隨機森林進一步分析土壤微生物互作網絡的拓撲性參數與土壤理化性質的關系（圖5），結果表明，細菌、真菌群落界內互作和細菌-真菌群落界間互作的主要影響因素是土壤中的 TC含量（P<0.05），其次為 TN含量（P<0.05）。且環境因子對細菌-真菌群落界間互作的解釋量更大。

利用方差分解分析（Variance Partitioning Analysis，VPA）分析土壤pH、SM、C（TC和DOC）和N（TN、-N和-N）對三層土壤微生物互作網絡的貢獻（圖6）。沿土壤剖面上中下三層微生物互作網絡的總解釋量分別為77.50%、92.29%和74.12%，土壤中的C和N是影響微生物互作網絡的主要因素，且隨著土壤深度的增加，土壤C的解釋量從3.58%增至32.67%。VPA結果表明表層土壤微生物更加受到N的影響而深層土壤微生物更加受到土壤C的影響，隨著深度的增加，影響微生物相互作用的環境因素由N轉變為C。

3 討 論

本研究通過構建分子生態網絡，探究了紅壤水稻土剖面細菌、真菌群落界內及界間的相互作用及其影響因素。研究表明，盡管細菌和真菌的豐富度隨土壤深度降低（圖2），但整體微生物互作網絡的拓撲參數顯著增強（表1），表明相比于表層土壤，深層土壤微生物之間有更復雜的網絡相互作用。這可能是由于農業系統中作物根系分泌物和地表凋落物主要增加了表層土壤中有機質的含量，并且施肥使表層土壤和深層土壤的養分差距變大，從而養分有效性隨土壤深度不同而顯著變化[25]，導致表層土壤微生物多樣性高而深層土壤微生物多樣性低，

微生物因土壤養分的減少而相互作用增加。這與Gu[26]和 Li[27]等的研究結果一致——施肥會引起土壤性質的改變從而顯著影響土壤微生物群落的組成及相互作用，深層土壤微生物互作網絡較表層土壤微生物互作網絡更加緊密復雜。資源的限制會導致細菌和真菌群落的相互作用由協作轉變為競爭[19]。本研究中微生物之間的負相互作用隨深度的增加而增加（圖3），這可能是由于土壤中碳和氮含量隨深度增加而減少，從而導致微生物之間的競爭作用加強。Banerjee等[28]的研究結果表明，豐富的有機物和營養物會使微生物互作網絡的負相互作用減少。

土壤微生物會借助趨化感應游向具有豐富營養物質的根際附近進行定殖與繁殖[29]，豐富的資源環境有利于微生物的生長與物質交換。隨著土壤深度的增加，土壤孔隙度減小，養分含量持續下降，影響了土壤微生物在充足營養源條件下的互作[30]，導致細菌、真菌群落界內互作增加，而界間互作減少（圖4）。有研究指出，土壤高 C/N有利于真菌生長，低C/N有利于細菌生長[29，31-32]。本研究與之相反，在較高C/N的中層土壤主要以細菌群落界內的正相互作用為主，在較低C/N的深層土壤主要以真菌群落界內的負相互作用為主，可能是由于表層土壤中含有大量易降解有機碳而深層土壤中的有機碳以難降解有機碳為主[33-34]，細菌更偏向于利用易降解有機碳，真菌更偏向于利用難降解有機碳[35-36]，所以導致表層土壤更適合細菌生長而深層土壤更適合真菌生長。Huang等[37]的研究表明不同深度稻田土壤剖面，微生物群落利用的碳源種類不同。細菌-真菌群落界間互作不僅會受到環境因素的影響還會受到土壤中其他生物相互作用的影響[18]。本研究紅壤細菌群落界內互作主要以正相互作用為主，真菌群落界內互作沿土壤剖面由正相互作用為主轉變為負相互作用為主（圖4）。Eldridge 等[38]的研究結果表明，土壤微生物網絡中細菌和真菌的接連差異主要取決于土壤受到的干擾程度，環境干擾會增加微生物群落結構的不穩定性[39]。供試土壤是典型水稻土，施肥增加了表層土壤養分含量。微生物之間的相互作用主要是受到養分的驅動，豐富的資源會減少微生物之間的負相互作用[21，28]，隨著土壤深度的增加，土壤養分含量減少，競爭性的相互作用在資源相對短缺時可能更加重要[21]，所以真菌需要通過競爭性的相互作用來滿足自身的需求。研究表明，根際土壤中的碳首先會被腐生真菌利用[40]。深層土壤中受到可利用碳組分的限制，細菌群落需要通過正相互作用來緩解環境的脅迫，同時擴大自己的生態位，以更好地獲取資源[41]。

已有報道表明，微生物群落結構和功能隨土壤剖面的變化顯著受到土壤中TN和TOC的影響[42]。本研究對典型紅壤水稻土的分析表明，土壤中C和N是影響細菌和真菌互作的主要因素（圖5），且隨土壤深度的增加，對微生物互作網絡的主要貢獻因素由N轉變為C（圖6）。Jangid 等[43]的研究結果表明，微生物群落的差異與土壤可礦化的 C、N含量和可提取的養分含量有關。Wan等[44]的研究結果表明，施氮肥會降低土壤 C/N，進而改變土壤微生物群落結構。氮肥的施加會降低表層土壤微生物生物量及細菌/真菌的比例[45]，所以N是表層土壤微生物互作的主要貢獻因素。由于土壤C-N轉化過程密切的偶聯效應，土壤有機質分解受到土壤N養分的控制。氮肥的添加緩和了表層土壤中N對微生物的限制，減輕了微生物需要通過礦化惰性有機質以獲取N的需求，使r策略微生物獲得更強的競爭優勢[46]。相比之下，深層土壤中可利用的碳源和氮源急劇減少，深層土壤微生物受到 C的影響增加。Fierer等[7]的研究結果表明，土壤碳的可利用性隨深度增加而下降，深層土壤微生物較表層土壤微生物更加受到土壤中C含量的限制，土壤中的C含量是細菌和真菌群落互作的主要驅動因素。

4 結 論

典型紅壤水稻土微生物相互作用網絡的拓撲性質如網絡的連通度、群聚系數和網絡密度等均與土壤的深度成正比；土壤深度越深，微生物的相互作用越緊密，模塊化越明顯，且細菌、真菌群落界內互作增加而細菌-真菌群落界間互作減弱。上層土壤以正相互作用為主，中層土壤以細菌群落界內正相互作用為主，下層土壤以真菌群落界內負相互作用為主。這主要受到土壤中C和N含量的影響，且隨著土壤深度的增加，土壤中C對微生物互作網絡影響顯著增加，微生物互作網絡最主要的貢獻因素由N轉變為C。