氟苯尼考光學異構體的分離測定方法研究

王宇，王炎，葉晶晶，章玉華，曾琴

(浙江海翔川南藥業有限公司，浙江 臺州 318000)

0 引言

氟苯尼考（Florfenicol）又稱氟甲砜霉素，化學名[R-(R*,S*)]-2,2-二氯-N-[1-(氟代甲基)-2-羥基-2-[4-(甲磺酰基)苯基]乙基]乙酰胺，是目前常用的一種獸用光譜抗菌藥，特點是抗菌譜廣、吸收良好、體內分布廣泛、抑菌作用強，最小抑菌濃度（MIC)低，抗菌效果是氯霉素、甲砜霉素的15～20倍，飼料給藥后60分鐘，組織中藥物濃度可達峰值，能迅速控制病情，有安全性高、無毒、無殘留等特點。沒有潛在致再生障礙性貧血的隱患，適合規模化大型養殖場使用，主要用于治療巴斯德氏菌和嗜血桿菌引起的牛呼吸道疾病。對梭桿菌引起的牛腐蹄病有較好療效。亦用于敏感菌所致的豬、雞傳染病及魚的細菌性疾病。

氟苯尼考化學結構中有兩個手性中心，因此存在4種分子異構體，但在實際生產中，通過控制合成工藝可得到兩個光學異構體即為氟苯尼考（如圖1所示）和氟苯尼考光學異構體（如圖2所示）。其中氟苯尼考左旋體構型（1 R,2 S）具有抗菌活性，而氟苯尼考右旋光學異構體構型（1 S,2 R）無活性并對氟苯尼考的活性有一定的抑制作用。因此氟苯尼考光學異構體含量的高低會直接影響氟苯尼考的藥效。

圖1 氟苯尼考

圖2 氟苯尼考光學異構

合成氟苯尼考工藝中，很多公司都是以甲砜霉素為起始原料。本公司是從氟苯尼考環合物開始，經過氟化、水解得到氟苯尼考，在反應過程中殘留的氟苯尼考環合物經過水解反應會生成甲砜霉素，且氟苯尼考高溫水解過程也有可能脫氟產生甲砜霉素，因此氟苯尼考的工藝雜質中均包含了氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素。目前氟苯尼考光學異構體的檢測方法主要是運用高效液相色譜法，使用Chiralpak AD-H色譜柱進行檢測[1]，該方法能夠有效分離氟苯尼考和氟苯尼考光學異構體，但對于氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素專屬性不強，基本保留時間相同，使檢測出的氟苯尼考光學異構體含量很不準確。

本研究通過篩選（CHIRALPAK? AD、CHIRALPAK? OD、CHIRALPAK? IA、CHIRALPAK? IB、CHIRALPAK? IC、CHIRALPAK? AY）六種不同手性色譜柱，及調節10種不同溶劑比例（正庚烷與醇溶劑混合、正己烷與醇溶劑混合等）篩選與開發得到一種可以有效分離氟苯尼考、氟苯尼考光學異構體、甲砜霉素雜質的檢測方法，并且對方法的專屬性、線性、精密度、回收率、定量限度進行方法學驗證，相關數據均良好。

1 方法與結果

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 260 液相色譜儀，包括G4 212 B二極管陣列紫外檢測器；CHIRALPAK? IC手性柱（4.6×250 mm,5 um,日本大賽璐）；OpenLAB Chemstation工作站。正己烷（默克）、正庚烷（默克）和乙醇（默克）均為色譜純。

1.2 標準品及樣品

氟苯尼考供試品（本公司制備）；氟苯尼考標準品、氟苯尼考光學異構體標準品和甲砜霉素標準品（均為本公司制備，并已進行標定，化學純度99.0%以上）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Chiralpak IC, 5 μm, 250×4.6 mm；流動相為正已烷：乙醇=870：130（v/v）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；紫外檢測波長為225 nm；進樣量為10 μL，稀釋液為乙醇。

1.4 溶液的制備

氟苯尼考標準品溶液：稱取30 mg氟苯尼考置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液A。氟苯尼考光學異構體標準品溶液：稱取30 mg氟苯尼考光學異構體置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液B。甲砜霉素標準品溶液：稱取30 mg甲砜霉素置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液C。

1.5 方法學驗證

1.5.1 專屬性

分別從儲備液B和儲備液C中各移取1 mL至盛有40 mg氟苯尼考標準品的50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度。依條件進樣，結果如圖3所示。相鄰峰之間的最小分離度為1.68，分離效果良好。氟苯尼考光學異構體拖尾因子為1.07、理論塔板數為8 068；氟苯尼考拖尾因子為1.15、理論塔板數為7 685；甲砜霉素拖尾因子為1.45、理論塔板數為6 294。

圖3 分離度圖譜

1.5.2 線性

分別從儲備液A、儲備液B和儲備液C中各移取2 mL于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度為儲備液D。從儲備液D中分別移取1 mL、2 mL、5 mL、8 mL、10 mL和12 mL至100 mL容量瓶中，配置成標準溶液進樣，記錄色譜圖，結果顯示氟苯尼考光學異構體、甲砜霉素和氟苯尼考在0.24～3.6 μg/mL的濃度范圍內，其峰面積對其濃度呈良好線性關系，線性系數分別為r=0.999 97，r=0.999 99，r=0.999 72。

1.5.3 系統精密度

配制1%的供試品溶液為對照溶液。連續進樣6次，記錄色譜圖，氟苯尼考主峰 RSD為0.37%。表明該方法系統精密度良好。

1.5.4 回收率（準確度）

取對照溶液連續進樣6針，供試品溶液連續進樣3針。分別從儲備液B和儲備液C中各移取2 mL于50 mL容量瓶中，用供試品溶液稀釋至刻度為儲備液E；從儲備液E中分別移取8 mL、10 mL和12 mL至100 mL容量瓶中，配置成質量濃度分別為，1.92 μg/mL、2.4 μg/mL和3.6 μg/mL的回收率溶液，每個濃度進樣3針，記錄色譜圖，氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素的回收率分別為92.9%～96.3%和93.4%～97.7%。方法準確度良好。

1.5.5 定量限度（LOQ）

進樣0.24 ug/mL的雜質溶液6針，記錄色譜圖，測定信噪比。氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素信噪比最小值分別為14.0和15.3，峰面積的RSD%分別為2.3%和4.4%。所以該優化條件下氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素的定量限濃度均為0.24 ug/mL。

1.5.6 檢測限度（LOD）

取3 mLLOQ溶液用稀釋液定容至10 mL，進樣并記錄色譜圖，測定信噪比。氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素信噪比最小值分別為4.7，4.2。所以該優化條件下氟苯尼考光學異構體和甲砜霉素的檢測限濃度均為0.072 μg/mL。

1.5.7 供試品測定

優化條件下，檢測3批氟苯尼考供試品。按照1%主成分自身對照法計算供試品中氟苯尼考光學異構體的含量，3批氟苯尼考供試品中氟苯尼考光學異構體的含量均小于0.3%。

2 結語

文章選用CHIRALPAK? IC手性柱建立了氟苯尼考光學異構體的高效液相色譜手性拆分的分析方法，該方法便捷、專屬性強、重現性好，可用于氟苯尼考光學異構體含量的日常檢測。