氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體的分離測定方法研究

王宇，王炎，葉晶晶，章玉華，曾琴

(浙江海翔川南藥業(yè)有限公司，浙江 臺州 318000)

0 引言

氟苯尼考（Florfenicol）又稱氟甲砜霉素，化學(xué)名[R-(R*,S*)]-2,2-二氯-N-[1-(氟代甲基)-2-羥基-2-[4-(甲磺酰基)苯基]乙基]乙酰胺，是目前常用的一種獸用光譜抗菌藥，特點(diǎn)是抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣泛、抑菌作用強(qiáng)，最小抑菌濃度（MIC)低，抗菌效果是氯霉素、甲砜霉素的15～20倍，飼料給藥后60分鐘，組織中藥物濃度可達(dá)峰值，能迅速控制病情，有安全性高、無毒、無殘留等特點(diǎn)。沒有潛在致再生障礙性貧血的隱患，適合規(guī)模化大型養(yǎng)殖場使用，主要用于治療巴斯德氏菌和嗜血桿菌引起的牛呼吸道疾病。對梭桿菌引起的牛腐蹄病有較好療效。亦用于敏感菌所致的豬、雞傳染病及魚的細(xì)菌性疾病。

氟苯尼考化學(xué)結(jié)構(gòu)中有兩個手性中心，因此存在4種分子異構(gòu)體，但在實(shí)際生產(chǎn)中，通過控制合成工藝可得到兩個光學(xué)異構(gòu)體即為氟苯尼考（如圖1所示）和氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體（如圖2所示）。其中氟苯尼考左旋體構(gòu)型（1 R,2 S）具有抗菌活性，而氟苯尼考右旋光學(xué)異構(gòu)體構(gòu)型（1 S,2 R）無活性并對氟苯尼考的活性有一定的抑制作用。因此氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體含量的高低會直接影響氟苯尼考的藥效。

圖1 氟苯尼考

圖2 氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)

合成氟苯尼考工藝中，很多公司都是以甲砜霉素為起始原料。本公司是從氟苯尼考環(huán)合物開始，經(jīng)過氟化、水解得到氟苯尼考，在反應(yīng)過程中殘留的氟苯尼考環(huán)合物經(jīng)過水解反應(yīng)會生成甲砜霉素，且氟苯尼考高溫水解過程也有可能脫氟產(chǎn)生甲砜霉素，因此氟苯尼考的工藝雜質(zhì)中均包含了氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素。目前氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體的檢測方法主要是運(yùn)用高效液相色譜法，使用Chiralpak AD-H色譜柱進(jìn)行檢測[1]，該方法能夠有效分離氟苯尼考和氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體，但對于氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素專屬性不強(qiáng)，基本保留時間相同，使檢測出的氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體含量很不準(zhǔn)確。

本研究通過篩選（CHIRALPAK? AD、CHIRALPAK? OD、CHIRALPAK? IA、CHIRALPAK? IB、CHIRALPAK? IC、CHIRALPAK? AY）六種不同手性色譜柱，及調(diào)節(jié)10種不同溶劑比例（正庚烷與醇溶劑混合、正己烷與醇溶劑混合等）篩選與開發(fā)得到一種可以有效分離氟苯尼考、氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體、甲砜霉素雜質(zhì)的檢測方法，并且對方法的專屬性、線性、精密度、回收率、定量限度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，相關(guān)數(shù)據(jù)均良好。

1 方法與結(jié)果

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 260 液相色譜儀，包括G4 212 B二極管陣列紫外檢測器；CHIRALPAK? IC手性柱（4.6×250 mm,5 um,日本大賽璐）；OpenLAB Chemstation工作站。正己烷（默克）、正庚烷（默克）和乙醇（默克）均為色譜純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品

氟苯尼考供試品（本公司制備）；氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品和甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品（均為本公司制備，并已進(jìn)行標(biāo)定，化學(xué)純度99.0%以上）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Chiralpak IC, 5 μm, 250×4.6 mm；流動相為正已烷：乙醇=870：130（v/v）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；紫外檢測波長為225 nm；進(jìn)樣量為10 μL，稀釋液為乙醇。

1.4 溶液的制備

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品溶液：稱取30 mg氟苯尼考置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液A。氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品溶液：稱取30 mg氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液B。甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液：稱取30 mg甲砜霉素置于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度作為儲備液C。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 專屬性

分別從儲備液B和儲備液C中各移取1 mL至盛有40 mg氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品的50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度。依條件進(jìn)樣，結(jié)果如圖3所示。相鄰峰之間的最小分離度為1.68，分離效果良好。氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體拖尾因子為1.07、理論塔板數(shù)為8 068；氟苯尼考拖尾因子為1.15、理論塔板數(shù)為7 685；甲砜霉素拖尾因子為1.45、理論塔板數(shù)為6 294。

圖3 分離度圖譜

1.5.2 線性

分別從儲備液A、儲備液B和儲備液C中各移取2 mL于50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度為儲備液D。從儲備液D中分別移取1 mL、2 mL、5 mL、8 mL、10 mL和12 mL至100 mL容量瓶中，配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體、甲砜霉素和氟苯尼考在0.24～3.6 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其峰面積對其濃度呈良好線性關(guān)系，線性系數(shù)分別為r=0.999 97，r=0.999 99，r=0.999 72。

1.5.3 系統(tǒng)精密度

配制1%的供試品溶液為對照溶液。連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，氟苯尼考主峰 RSD為0.37%。表明該方法系統(tǒng)精密度良好。

1.5.4 回收率（準(zhǔn)確度）

取對照溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣3針。分別從儲備液B和儲備液C中各移取2 mL于50 mL容量瓶中，用供試品溶液稀釋至刻度為儲備液E；從儲備液E中分別移取8 mL、10 mL和12 mL至100 mL容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度分別為，1.92 μg/mL、2.4 μg/mL和3.6 μg/mL的回收率溶液，每個濃度進(jìn)樣3針，記錄色譜圖，氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素的回收率分別為92.9%～96.3%和93.4%～97.7%。方法準(zhǔn)確度良好。

1.5.5 定量限度（LOQ）

進(jìn)樣0.24 ug/mL的雜質(zhì)溶液6針，記錄色譜圖，測定信噪比。氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素信噪比最小值分別為14.0和15.3，峰面積的RSD%分別為2.3%和4.4%。所以該優(yōu)化條件下氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素的定量限濃度均為0.24 ug/mL。

1.5.6 檢測限度（LOD）

取3 mLLOQ溶液用稀釋液定容至10 mL，進(jìn)樣并記錄色譜圖，測定信噪比。氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素信噪比最小值分別為4.7，4.2。所以該優(yōu)化條件下氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體和甲砜霉素的檢測限濃度均為0.072 μg/mL。

1.5.7 供試品測定

優(yōu)化條件下，檢測3批氟苯尼考供試品。按照1%主成分自身對照法計算供試品中氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體的含量，3批氟苯尼考供試品中氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體的含量均小于0.3%。

2 結(jié)語

文章選用CHIRALPAK? IC手性柱建立了氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體的高效液相色譜手性拆分的分析方法，該方法便捷、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可用于氟苯尼考光學(xué)異構(gòu)體含量的日常檢測。