芪骨膠囊治療絕經后骨質疏松癥的分子機制

張潔帆 許坤 陳元川 郭海玲 龐堅* 趙詠芳

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院石氏傷科醫學中心，上海 200120

2.上海市中醫藥研究院骨傷科研究所，上海 200120

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是由于女性絕經后雌激素水平下降造成骨密度和骨量下降，導致骨強度受損、骨折風險增加的全身代謝性骨病[1]。調查[2]顯示，我國50歲以上女性人群骨質疏松癥患病率為20.7%，隨著社會老齡化進程的不斷加劇，未來患病率可能會繼續升高。目前指南推薦的一線藥物并不十分符合臨床預期，尤其是藥物的不良副反應受到關注，例如：雙膦酸鹽類藥物相關的胃腸道反應、腎臟毒性、下頜骨壞死、非典型股骨骨折等，雌激素類藥物可增加子宮內膜癌、乳腺癌、血栓發生等風險[3]。因此，新療法、新制劑的研發仍是骨質疏松癥研究領域的重要課題。

芪骨膠囊為上市中藥制劑，原名密骨膠囊、補腎方，來源于石印玉教授治療骨質疏松癥的經驗方[4-5]，《中醫藥防治原發性骨質疏松癥專家共識》推薦用于PMOP治療[6]。臨床研究[4,7-9]顯示其可維持PMOP患者骨密度，并改善腰背痛、腰膝酸軟無力、頭目眩暈等肝腎不足的臨床癥狀，基礎研究[10-14]顯示其能抑制破骨細胞破骨功能并促進成骨細胞增殖與礦化能力，但在分子水平的研究仍有待深入。在本研究中,課題組嘗試通過網絡藥理學方法，探討芪骨膠囊治療PMOP的活性成分及具體分子機制，以期為后續的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選芪骨膠囊活性成分及相關靶點

本研究運用BATMAN-TCM數據庫[15]，分別以“HESHOUWU”“SHIHU”“YINYANGHUO”“ROU CONGRONG”“HUANGQI”“GUSUIBU”“JUHUA”為關鍵詞進行檢索，再以Score_cut off≥35且AdjustedP-value<0.05為條件進行篩選，獲得芪骨膠囊的藥物活性成分及其相對應的潛在靶點。

1.2 獲取PMOP的疾病靶點

1.2.1GEO芯片分析PMOP的疾病靶點：在GEO數據庫中下載編號為GSE7158的基因芯片原始文件及平臺數據，該基因芯片是對26例峰值骨量(PBM)高低不同的中國女性的循環單核細胞進行全基因組基因差異表達研究，其中低PBM12例，高PBM14例。本研究運用R軟件(v4.0.0)，以P<0.05且|lgFC|>1為條件，對該基因芯片進行二次分析，篩選出差異基因，并繪制熱圖和火山圖。

1.2.2檢索已知的PMOP疾病靶點：本研究運用GeneCards數據庫，以“postmenopausal osteoporosis”為關鍵詞，搜索與PMOP相關的疾病靶點，并將數據導出，篩選出相關性得分(Relevance score)最高的前300個靶點。

1.3 獲取“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點

運用R軟件將1.1中篩選獲得的芪骨膠囊藥物活性成分對應的潛在靶點與1.2中獲得的PMOP靶點取交集獲得“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點。

1.4 繪制“藥物-活性成分-靶點”網絡圖

將1.1中獲得的芪骨膠囊的藥物活性成分及其相對應的潛在靶點與1.3中所獲得的“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點數據進行處理之后導入Cytoscape軟件(v3.7.0)中，繪制出“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。

1.5 構建“芪骨膠囊-PMOP”蛋白互作(PPI)網絡

將1.3中獲得的“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點導入String在線軟件(https://string-db.org/，v11.0)，選擇物種為“Homo sapiens”，設置最小互作得分為0.7，構建出PPI網絡圖，并導出數據。

1.6 篩選“芪骨膠囊-PMOP”核心靶點

對1.5中導出的數據進行處理，將PPI網絡中連接節點最多的前30個靶點篩選出來作為“芪骨膠囊-PMOP”核心靶點，并繪制出核心靶點條形圖。

1.7 GO功能和KEGG通路富集分析

為了進一步明確芪骨膠囊治療PMOP的分子機制，本研究運用R軟件將1.6中獲得的“芪骨膠囊-PMOP”核心靶點進行GO(gene ontology)功能和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，并根據富集程度選取排名前20的GO生物過程和KEGG通路分別繪制出條形圖。

2 結果

2.1 篩選芪骨膠囊活性成分及相關靶點

本次研究通過檢索BATMAN-TCM數據庫，共獲得芪骨膠囊89個活性成分，對89個活性成分進行靶點預測，并剔除重復靶點后，一共獲得558個相關靶點，見表1、表2。

表1 芪骨膠囊成分靶點數量

表2 芪骨膠囊主要活性成分表

2.2 獲取PMOP的疾病靶點

2.2.1GEO芯片分析PMOP的疾病靶點：本研究運用通過使用R軟件limma包對編號為GSE7158的基因芯片進行二次分析，共得到差異基因479個(上調基因232個，下調基因247個)，選取前40個差異基因繪制出火山圖和熱圖，見圖1、圖2。

圖2 差異基因火山圖

2.2.2檢索已知的PMOP疾病靶點：在GeneCards數據庫中，以“postmenopausal osteoporosis”為關鍵詞，搜索與PMOP相關的疾病靶點，共獲得PMOP疾病靶點1 073個，篩選出相關性得分最高的前300個靶點。

2.3 獲取“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點

將2.2.1和2.2.2中獲得的靶點進行匯總并剔除重復靶點后，與2.1中獲得的芪骨膠囊相關靶點取交集，最后得到57個“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點。

2.4 繪制“藥物-活性成分-靶點”網絡圖

通過對芪骨膠囊的藥物活性成分及其相對應的潛在靶點與“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點數據進行處理，結果顯示57個“芪骨膠囊-PMOP”交集靶點共涉及67個活性成分。使用Cytoscape軟件繪制出“藥物-活性成分-靶點”網絡圖，見圖3。

圖3 “藥物-成分-靶點”網絡圖

2.5 構建“芪骨膠囊-PMOP”PPI網絡，篩選核心靶點

通過String在線軟件構建得到“芪骨膠囊-PMOP” PPI網絡(圖4)，圖中節點表示芪骨膠囊和PMOP的交集靶點，節點之間的連線表示靶點之間的相互作用關系，連線越多，則該節點在PPI網絡中的相互作用關系越強。將該PPI網絡中相互作用關系最強的前10個靶點篩選為“芪骨膠囊-PMOP”核心靶點，見圖5。

圖5 核心靶點條形圖

2.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析

將芪骨膠囊治療PMOP的潛在靶點進行GO生物過程和KEGG通路富集分析，根據P<0.05進行篩選，結果得到芪骨膠囊治療PMOP的作用機制可能與女性懷孕(female pregnancy)、多細胞生物過程(multi-multicellular organism process)等多個生物過程相關，見圖6。且這些潛在靶點顯著富集于雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、卵巢甾體生成(ovarian steroidogenesis)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、白細胞介素17信號通路(IL-17 signaling pathway)等通道，見圖7。

圖6 GO生物過程富集分析

圖7 KEGG通路富集分析

3 討論

芪骨膠囊由七味藥組成，其用藥精簡，配伍嚴密。通過對芪骨膠囊活性成分及靶點的篩選，筆者發現肉蓯蓉、菊花、黃芪的的degree值高于其它成分，進一步檢索后獲得67個主要活性成分與PMOP相關，主要活性成分來源中菊花、黃芪、肉蓯蓉的藥物靶點數依然位居前三。據韓國植物資源研究所報道[16]，菊花提取物中主要成分α-蒎烯(alpha-pinene)、菊油環酮(chrysanthenone)是有著揮發性香氣的化合物，具有增強成骨細胞堿性磷酸酶活性和促進細胞膠原合成及鈣沉積的作用。來源于黃芪的β-谷甾醇(beta-sitosterol)、γ-谷甾醇(gamma-sitosterol)均屬于甾醇類化合物，具有雌激素樣活性，能與機體內的雌激素受體結合產生雌激素樣作用[17]。苯丙氨酸(phenylalanine)作為人體必需氨基酸之一，是合成代謝苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides, PhGs)的重要原料。PhGs是肉蓯蓉的主要活性成分[18]，其中以松果菊苷為指標性成分[19]。在去卵巢大鼠的實驗研究[20]中觀察到松果菊苷能改善大鼠股骨骨密度及骨微結構，同時可顯著提高骨保護素(OPG)水平，以及降低RANKL受體激活水平，可以有效預防去卵巢誘導的大鼠骨質疏松。在MC3T3-E1細胞體外研究中也顯示松果甘油能通過增加OPG/RANNKL比值促進骨再生[21]。

對藥物作用靶點進一步聚焦后發現，胰島素(INS)、白介素-6(IL-6)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)等10個靶點是芪骨膠囊治療PMOP的核心靶點，這表明芪骨膠囊可能是通過以上靶點產生治療PMOP的作用。INS是人體內分泌的一種可以降低血糖的蛋白質激素，多項研究[22-24]表明INS的使用會導致骨折風險增加、骨密度降低。IL-6是重要的炎癥細胞因子,在骨質疏松中起著關鍵作用[25]。有研究[26]表明炎癥是導致PMOP的重要因素之一,IL-6等細胞因子可通過作用于成骨細胞上的受體間接刺激骨吸收。De等[27]通過研究發現IL-6過表達的轉基因小鼠表現出骨質減少，骨微結構改變，成骨細胞減少、破骨細胞數量和活性增加等骨質疏松特征。IGFs是骨基質中含量最豐富的生長因子，是維持骨生長的重要調節因子[28],IGF-1水平的下降會導致骨量降低[29]。課題組以往研究顯示[13]，芪骨膠囊含藥血清對成骨細胞IGF-1的分泌有促進作用，同時會增加成骨細胞的增值率、堿性磷酸酶以及礦化結節數，這可能與芪骨膠囊調控細胞因子IGF-1的表達與分泌有關。上述結果與本研究結果基本一致，凸顯了芪骨膠囊通過多靶點調節骨代謝治療PMOP的特點。

GO生物過程富集分析結果顯示，芪骨膠囊治療PMOP的分子機制與與女性懷孕、多細胞生物過程、維生素D代謝過程、激素氧代謝過程等生物過程相關。KEGG通路富集分析結果顯示，潛在靶點主要富集在：雌激素信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、白細胞介素17信號通路。以上研究報道與本研究結果相一致，表明芪骨膠囊通過多通路治療PMOP的結果具有一定的可靠性。

通過對“藥物-成分-靶點-通路”的分析比較，芪骨膠囊治療PMOP的作用機制可能與菊花、黃芪、肉蓯蓉中的主要有效成分如α-蒎烯、菊油環酮、β-谷甾醇、γ-谷甾醇、苯乙醇苷等有較強相關性，并通過雌激素、白細胞介素等信號通路作用于人體INS、ALB、IL-6、AKT-1、IGF-1等靶點發揮療效。通過該研究，可為芪骨膠囊治療PMOP在分子層面提供新的研究方向和思路，對治療PMOP的用藥進行方劑優化及新藥研發的理論指導。本次研究基于生物信息學方法探討了芪骨膠囊治療PMOP可能的分子機制，但由于網絡數據庫和所涉及的工具算法等有著一定的局限性，因此具體的分子機制還需要通過嚴謹周密的實驗進行驗證。