混合菌輔助發酵羊肉香腸研制及產品質量分析

劉浩，吳葉，張建萍，陳尚龍，劉輝

(徐州工程學院江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018)

羊肉是一種低脂、低膽固醇、高蛋白的肉類食品，富含脂肪27.9%(低于豬肉)，優質蛋白10.9%(高于豬肉)，相比于其他畜禽肉，羊肉富含更多的鈣、鐵、磷、碘等礦物質，并且含有人體所需要的維生素B1、B2[1]。

發酵香腸是利用微生物的發酵作用，通過將肉、脂肪、香辛料、發酵劑等混合均勻后灌入腸衣，再經過后期干燥成熟，制成的pH低于5.3，能夠在常溫下貯藏運輸，兼具風味與色澤的發酵肉制品[2]。在我國不同的地方有著各自特色的香腸，如廣東香腸、江蘇如皋香腸、東北紅腸等。我國傳統發酵香腸風味獨特、易于貯藏、食用方便，可直接拼盤食用，也可煎、炒、烹、炸，深受消費者的歡迎，但是存在著生產周期過長、鹽分含量過高、香腸品質參差不齊的問題，甚至存在生物胺、致病菌等嚴重的食品安全隱患[3]。隨著科技進步，傳統的發酵香腸工藝已不適應現代化的要求，現代發酵香腸已實現了規模化、標準化生產，在縮短周期的同時還提高了產品品質，但是致病菌、生物胺等食品安全隱患依然存在。過酸、高脂高鹽的加工不能滿足消費者對食品品質的要求，因此低脂低鹽、具有益生性的發酵香腸具有很大的市場潛力[4]。

乳桿菌屬是發酵香腸中最重要的微生物菌群，發酵香腸常用的乳桿菌主要有清酒乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌等[5]。這類細菌生長以糖類為營養物質，分解產生乳酸，乳酸能夠降低發酵香腸的pH，香腸的pH降低后，致病菌和雜菌的生長受到抑制，從而延長發酵香腸的貨架期[6]。由于單一菌種發酵過程中會出現生物胺、亞硝酸鹽積累的風險，所以現在發酵香腸中越來越多地采用復配發酵劑。復配發酵劑是將幾種發酵劑按比例混合，彌補單一菌種發酵劑的缺陷，發揮各菌種的優勢，提高香腸的風味品質[7]。

我國羊肉產量位居世界第一，但是對羊肉的消費大多停留在生鮮肉階段，多見于火鍋、紅燒、烤制等烹調方式中[8]。由于羊肉特有的膻味，傳統香腸基本以豬肉為原料，很少見到用羊肉灌制香腸，利用發酵劑發酵香腸，在一定程度上可以抑制膻味，改善香腸的色澤和品質，延長貨架期[9]，促進我國畜牧業發展，為消費者提供一種新型羊肉制品，在滿足消費者味蕾的同時兼具營養價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：羊后腿瘦肉、豬背膘：徐州云龍萬達永輝超市；天然豬腸衣：申源腸衣品牌直銷店。

輔料：食用鹽、蔗糖、白酒、白胡椒粉、蒜粉、姜粉：徐州云龍萬達永輝超市；葡萄糖：山家人；亞硝酸鈉：山東優索化工科技有限公司；D-異抗壞血酸鈉：糖柜旗艦店。

發酵劑：植物乳桿菌、木糖葡萄球菌：徐州工程學院微生物實驗室提供。

試劑：苯酚(AR)、石油醚(AR)：天津福晨化學試劑廠；鹽酸萘乙二胺(AR)：天津市科密歐化學試劑有限公司；冰乙酸(AR)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

pH-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；7230G可見分光光度計 上海圣科儀器設備有限公司；BGZ-70電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療器械廠；立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司；S2-A81絞肉機 九陽股份有限公司；DK-98-II型萬用電爐 天津泰斯特儀器有限公司；旋轉蒸發儀 江蘇德睿科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵羊肉香腸工藝流程

原料肉預處理(去筋、漂洗)：瘦肉絞碎→肥肉切丁→加入輔料及腌制劑→攪拌均勻→低溫腌制→接種混合菌發酵劑→灌腸→恒溫發酵24 h→干燥成熟。

基本配方：新鮮羊瘦肉(去筋)與豬背膘質量比為8∶2，蔗糖1%，葡萄糖0.6%，食鹽3%，白胡椒0.1%，姜粉0.2%，蒜粉0.2%，白酒1.2%，冰水10%，亞硝酸鈉0.010%，D-異抗壞血酸鈉0.075%(均為在羊肉中的質量分數)。

1.3.2 菌株之間的拮抗作用

用接種環挑取單菌落，在固體培養基上劃一條直線，37 ℃培養24 h后，再用接種環挑取另一菌株，沿菌落邊緣從垂直方向接種，繼續培養24 h，觀察是否存在抑菌區[10]。

1.3.3 單因素實驗

探究接種量對發酵羊肉香腸品質的影響時，將接種量作為變量，控制植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1∶1、發酵溫度30 ℃、相對濕度90%、發酵時間24 h不變，5組發酵香腸分別接種104，105，106，107，108CFU/g，測定24 h后發酵香腸的pH，待發酵香腸成熟后進行感官評分。

探究發酵溫度對發酵羊肉香腸品質的影響時，將發酵溫度作為變量，控制植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1∶1、接種量107CFU/g、相對濕度90%、發酵時間24 h不變，5組發酵香腸分別于15，20，25，30，35 ℃下發酵，測定24 h后發酵香腸的pH，待發酵香腸成熟后進行感官評分。

探究菌種配比對發酵羊肉香腸品質的影響時，將菌種配比作為變量，控制接種量107CFU/g、發酵溫度30 ℃、相對濕度90%、發酵時間24 h不變，5組發酵香腸分別接種植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌比例為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的混合菌，測定24 h后發酵香腸的pH，待發酵香腸成熟后進行感官評分。

1.3.4 響應面實驗設計

根據Box-Behnken實驗設計原理，結合單因素實驗結果，用Design-Expert 8.0.6軟件，選取感官評分為響應值，進行三因素三水平共17個實驗點的中心組合實驗[11]，對混合菌發酵羊肉香腸工藝進行優化，對響應曲面得出的最佳配比進行感官評分，各因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素和水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.5 發酵香腸pH的測定

參照GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》規定的方法，將香腸視為非均質化試樣，使用校準后的pH計，貼于已用小刀打孔的香腸中，讀數穩定后，可直接讀出pH，同一點重復測定3次，讀數精確至0.01[12]。發酵香腸pH必須在48 h內降低至5.3才能保證香腸的安全性[13]。

1.3.6 感官評分體系

選擇來自不同省份的16名(8男8女)經過食品感官鑒評專業培訓的學生組成感官鑒評小組，要求從色澤、組織結構、膻味、口感4個方面進行評分，每位同學必須對所有樣品進行評分，評分過程中不允許交流。每次評分之前，需用溫水漱口，10 min后進行下一次評定，減少連續品嘗帶來的不利影響，具體評分標準見表2。

表2 感官評分體系Table 2 The sensory scoring system

1.3.7 發酵香腸品質評價標準

發酵羊肉香腸隸屬于中式香腸，必須符合GB/T 23493-2009[14]《中式香腸》標準，其他肉制品標準也必須符合，見表3。

表3 中式香腸理化標準Table 3 The physicochemical indexes of Chinese sausage

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵溫度對香腸pH、感官評分的影響

由圖1可知，發酵24 h后，20 ℃和25 ℃的兩組香腸pH下降至5.89，5.42，均高于5.3，不符合標準；30 ℃和35 ℃的兩組香腸pH最終降至4.88，4.46，均低于5.30，綜合感官評分來看，35 ℃組由于過酸，感官評分低于30 ℃組，所以發酵溫度為30 ℃時香腸整體品質最佳。

圖1 發酵溫度對香腸pH、感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the pH values and sensory scores of sausage

2.1.2 接種量對香腸pH、感官評分的影響

由圖2可知，發酵24 h后，接種量為104,105CFU/g的發酵香腸pH降至5.65,5.48，高于5.30，不符合標準，接種106,107,108CFU/g的發酵香腸pH最終下降到5.16，4.84，4.28，均低于5.3，考慮到香腸成熟過程中，香腸pH會出現一定程度的回升[15]，不能很好地確保安全，故接種量為106CFU/g的香腸不予考慮。接種量為108CFU/g的香腸pH下降得太低，酸味過于強烈。結合感官評分來看，接種量為107CFU/g的發酵香腸評分最高，所以接種量為107CFU/g比較合適。

圖2 接種量對香腸pH、感官評分的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the pH values and sensory scores of sausage

2.1.3 菌種配比對香腸pH、感官評分的影響

由圖3可知，5組香腸發酵24 h后pH均低于5.3，符合標準，植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌為3∶1時pH最低，主要是由于該組乳酸菌比例最高。pH過低時，發酵香腸過酸，消費者很難接受，綜合感官評分來看，復配比為1∶1時最合適。

圖3 菌種配比對香腸pH、感官評分的影響Fig.3 Effect of strain ratios on the pH values and sensory scores of sausage

2.2 響應面優化實驗結果及方差分析

2.2.1 響應面實驗結果

表4 響應面實驗設計及結果Table 4 Response surface experiment design and results

利用Design-Expert 8.0.6進行回歸擬合得到接種量、復配比、發酵溫度對香腸感官評分的二次多項式回歸方程為：Y=+84.45-1.61A+1.16B+0.70C+0.34AB-0.75AC+0.093BC-8.84A2-3.05B2-3.40C2。R2=0.9656，校正系數RAdj2=0.9213，表明響應值變化的96.56%能用該模型解釋。對該模型進行方差分析，結果見表5。

表5 響應面方差分析結果Table 5 Response surface variance analysis results

由表5方差分析結果可知，該模型極顯著，失擬項不顯著，A2、B2、C2對模型的影響極顯著，影響感官評分的各因素順序為：接種量>復配比>發酵溫度。

2.2.2 因素間的交互作用分析

由圖4～圖6可知，3種因素兩兩之間的交互作用不明顯，綜上所述，植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1.39∶1、接種量6.69 1g CFU/g、發酵溫度30.58 ℃時制得的發酵香腸最佳，此時感官評分為85.43。

圖4 復配比和接種量對發酵羊肉香腸感官評分交互作用的響應曲面Fig.4 Response surface of the interaction of mixed ratio and inoculation amount on sensory score of fermented mutton sausage

圖5 接種量和發酵溫度對發酵羊肉香腸感官評分交互作用的響應曲面Fig.5 Response surface of the interaction between inoculation amount and fermentation temperature on sensory score of fermented mutton sausage

圖6 復配比和發酵溫度對發酵羊肉香腸感官評分交互作用的響應曲面Fig.6 Response surface of the interaction of mixed ratio and fermentation temperature on sensory score of fermented mutton sausage

2.2.3 驗證實驗

為了滿足實際生產的需求，將最佳工藝參數調整為：植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1∶1，接種量107CFU/g，發酵溫度30 ℃，發酵時間24 h。進行3次驗證實驗，發酵香腸的感官評分平均值為85.15，與模型理論值相近，說明該工藝條件即最佳工藝條件。

2.3 發酵羊肉香腸質量分析結果

對采用最佳工藝制備的香腸與未添加混合菌種的普通羊肉香腸對照進行質量分析，見表6。

表6 質量分析Table 6 The analysis of quality

發酵香腸中的各項指標均符合國家標準，發酵組的水分含量明顯低于對照組，說明添加混合菌有助于羊肉香腸水分含量的降低，較低的水分含量可以抑制微生物生長，提高香腸的安全性。添加發酵劑的香腸中，微生物細胞內含有的蛋白酶可能使蛋白質分解，蛋白質含量低于未添加混合菌的香腸。由于植物乳桿菌利用葡萄糖產酸，發酵組的總糖含量低于普通香腸。發酵香腸的過氧化值和亞硝酸鹽含量低于普通香腸，混合菌能夠抑制亞硝酸鹽的產生，在一定程度上提高了發酵香腸的安全性，發酵香腸的安全性和貯藏性更好。

3 結論

以感官評分、pH值作為評價香腸的理化指標，確定香腸的最佳發酵時間，通過單因素實驗，確定菌種配比、發酵溫度、接種量最佳配比的范圍，在單因素實驗的基礎上，以感官評分為響應值，進行三因素三水平的響應面分析，當接種量為107CFU/g，發酵溫度為30 ℃，植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌配比為1∶1時，發酵羊肉香腸的品質最佳。

以中式香腸國家標準為依據，對貯藏30 d的發酵羊肉香腸進行產品質量分析，添加混合菌的發酵羊肉香腸的水分含量、總糖含量、氯化物含量、蛋白質含量和脂肪含量均低于未添加發酵劑的香腸，混合菌發酵香腸更健康、安全，符合國家特級中式香腸的要求；添加混合菌的發酵羊肉香腸的過氧化值和亞硝酸鹽含量低于未添加發酵劑的香腸，遠低于國家標準規定的殘留量，說明混合菌發酵香腸能夠延長貨架期，提高產品質量。