柳州酸筍中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定

熊建文，桂揚，周小玲，陳正培，吳錦蘭，崔娜，鞏僖

(柳州工學院 食品與化學工程系，廣西 柳州 545616)

隨著人民生活水平的普遍提高，膳食營養越來越豐富，人群平均血清總膽固醇(cholesterol，TC)水平顯著升高，由此引發的心腦血管疾病已成為威脅人類健康的頭號殺手[1]。服用降膽固醇的藥物雖然能有效控制體內膽固醇含量，但同時容易引起肝酶異常、腎功能受損等副作用[2]。作為國際公認的食品級益生菌，乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)大量存在于人體和動物體的腸道內，具有維持胃腸道微生態平衡、提高機體免疫力等重要生理功能[3-4]。同時，乳酸菌也是發酵食品中的重要細菌，在發酵食品和飲料的生產中具有長期和安全的應用和消費歷史[5]。有研究表明，一些乳酸菌具有降膽固醇的能力，能產生高活性的膽汁鹽水解酶和膽固醇氧化酶，在降解膽固醇及其同系物上起到了重要作用[6-8]。這為降低血清中膽固醇含量的研究提供了新的方向，而獲得高效降膽固醇的乳酸菌菌株是利用乳酸菌降低膽固醇技術的關鍵，已成為近年來的研究熱點[9]。馬長路等[10]從自然發酵的傳統東北酸菜中篩選出了降解膽固醇的優良乳酸菌，并且這類降解膽固醇的乳酸菌在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryneformes)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)中均有存在。

酸筍(fermented bamboo shoot)是我國南方地區傳統特色發酵食品，也是柳州螺螄粉的重要輔料，因其獨特的風味，深受人們鐘愛。酸筍是利用竹筍中自然附著的乳酸菌發酵而制成，其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源[11]。目前有關酸筍的研究主要集中在其營養成分、風味物質和制作工藝上[12-14]，而有關酸筍中功能性乳酸菌的研究仍相對匱乏。本研究以柳州傳統發酵酸筍為原料，采用MRS-CaCO3培養基對酸筍發酵液中的乳酸菌進行分離，通過硫酸鐵銨顯色法對降膽固醇乳酸菌進行篩選，隨后對該優良菌株進行分子生物學鑒定，最后探究影響降解膽固醇能力的因素，為開發降膽固醇功能性乳酸菌產品提供了參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 原料

酸筍自然發酵液樣品：采集于廣西柳州市。

1.1.2 化學試劑

牛肉膏、酵母浸粉、細菌學蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、多聚蛋白胨和瓊脂粉：廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉和蔗糖：國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈣：廣東光華科技股份有限公司；瓊脂糖：Biowest公司；膽固醇：上海麥克林生化科技有限公司；牛膽鹽：上海源葉生物科技有限公司；DNA 提取試劑盒：北京天根生化試劑有限公司；Ⅱ型核酸染料：Pitoop公司。

1.1.3 培養基

按文獻[15]配制MRS液體培養基；MRS固體培養基：MRS液體培養添加質量濃度為15 g/L的瓊脂；含碳酸鈣MRS培養基：在MRS培養基中添加3 g/L的碳酸鈣；含膽固醇MRS-CHOL培養基：在MRS培養基中添加0.2%牛膽鹽、100 μg/mL或者200 μg/mL膽固醇。

1.1.4 儀器與設備

SW-CJ-2F 超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；ZQLY-180S振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；H1650R高速離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司；HH-S6數顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；Master-S15超純水機 上海和泰儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；Nikon Eclipse E200生物顯微鏡 日本尼康公司；GenoSens 1880凝膠成像分析系統 上海勤翔科學儀器有限公司；L9800基因擴增儀 北京萊普特科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酸筍中乳酸菌的分離與純化

將采集的酸筍發酵液樣品梯度稀釋(10-1～10-6)后，利用傾注法接種在MRS-CaCO3固體培養基平板上，于37 ℃恒溫培養24 h，挑取溶鈣圈明顯的菌落，在MRS多次純化后進行甘油保存。

1.2.2 降膽固醇乳酸菌的初篩

取1環目標菌株，接種到MRS液體培養基中，于37 ℃培養10 h，調整菌液的OD600 nm值為0.6，將其作為種子液，按1%(V/V)的接種量接種于含有100 μg/mL膽固醇的MRS-CHOL液體培養基中，37 ℃恒溫靜置培養48 h。取30 μL發酵液置于2 mL離心管中，加入1.5 mL無水乙醇，混勻后于10000 r/min離心2 min，取1.0 mL上清液于試管中，加入1.0 mL硫酸鐵銨顯色液，先搖勻混合，待冷卻后于波長560 nm處測定吸光度值。繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程計算膽固醇含量，并按下列公式計算膽固醇降解率。

式中：D為菌株的膽固醇降解率，%；C0為原培養基中膽固醇質量濃度，μg/mL；C1為測試菌株發酵后上清液樣品膽固醇質量濃度，μg/mL。

1.2.3 降膽固醇乳酸菌的復篩

按1%的接種量(V/V)將目標菌株接種于含有200 μg/mL膽固醇的MRS-CHOL液體培養基中，在37 ℃下恒溫靜置培養48 h，測定發酵液中的膽固醇含量，計算降解率，方法同上。

1.2.4 降膽固醇菌株的初步鑒定

1.2.4.1 形態學觀察

將目標菌株在MRS固體培養基上進行培養，觀察菌株的菌落形態特征，再對菌株進行革蘭氏染色，觀察菌體細胞形態特征，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，進行初步形態學鑒定。

1.2.4.2 分子生物學鑒定

利用16S rDNA測序法對菌株進行分子生物學鑒定，具體方法參考文獻[15]。

1.2.5 不同因素對乳酸菌降解膽固醇能力的影響

碳源的影響：分別按比例使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉等碳源作為200 μg/mL含膽固醇MRS-CHOL液體培養基的碳源，將目標菌株的種子液按照1.0%(V/V)接種量接種到上述培養基中，于37 ℃恒溫靜置培養，分別在24 h和48 h后，測定每組發酵液中膽固醇含量，考察不同碳源對菌株降解膽固醇能力的影響。

氮源的影響：分別按比例使用蛋白胨、胰蛋白胨、細菌學蛋白胨、多聚蛋白胨等氮源作為含200 μg/mL膽固醇MRS-CHOL液體培養基的氮源進行上述菌株降解膽固醇試驗，培養24 h和48 h后，測定每組發酵液中膽固醇含量，考察不同氮源對菌株降解膽固醇能力的影響。

接種量的影響：分別取1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的接種量接入到含200 μg/mL膽固醇MRS-CHOL液體培養基中進行上述菌株降解膽固醇試驗，培養24 h和48 h后，測定每組發酵液中膽固醇含量，考察不同接種量對菌株降解膽固醇能力的影響。

pH值的影響：將含200 μg/mL膽固醇MRS-CHOL液體培養基的pH值分別調節為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的條件下進行上述菌株降解膽固醇試驗，培養24 h和48 h后，測定每組發酵液中膽固醇含量，考察不同pH值對菌株降解膽固醇能力的影響。

溫度的影響：將培養溫度分別設置為 22，27，32，37，42 ℃的條件下進行上述菌株降解膽固醇試驗，培養24 h和48 h后，測定每組發酵液中膽固醇含量，考察不同溫度對菌株降解膽固醇能力的影響。

2 結果與分析

2.1 酸筍中乳酸菌的分離

利用MRS-CaCO3培養基對酸筍發酵液的乳酸菌進行分離，得到48株形態均一的白色菌株，菌落周圍都出現典型的溶鈣圈，將其純化后進行編號，分別為LZ-1-1～LZ-1-24、LZ-2-1～LZ-2-24。

2.2 降膽固醇乳酸菌的初篩和復篩

在 100 μg/mL膽固醇質量濃度下48株菌的膽固醇降解率結果見表1。初篩結果顯示，不同的菌株降膽固醇能力不同，其中菌株LZ-1-8、LZ-1-10、LZ-1-14、LZ-2-11、LZ-2-12、LZ-2-14、LZ-2-15、LZ-2-19、LZ-2-20、LZ-2-22的膽固醇降解率均超過60%。

表1 48株菌的膽固醇降解率Table 1 The degradation rates of cholesterol of 48 strains

對這10株菌膽固醇降解率進行復篩，結果見表2，復篩結果表明，這10株菌膽固醇的降解能力大小依次為菌株LZ-2-12>菌株LZ-1-10>菌株LZ-2-14>菌株LZ-2-19>菌株LZ-1-14>菌株LZ-2-22>菌株LZ-2-15>菌株LZ-2-20>菌株LZ-1-8>菌株LZ-2-11，其中菌株LZ-2-12膽固醇降解率最大，平均值為54.27%。因此，對菌株LZ-2-12進行下一步試驗。

表2 200 μg/mL膽固醇濃度下10株菌的膽固醇降解率Table 2 The degradation rates of cholesterol of 10 strains with cholesterol concentration of 200 μg/mL

2.3 降膽固醇菌株的鑒定結果

菌株LZ-2-12在MRS培養基培養24 h后，菌落形態為圓形、乳白色、表面光滑、邊緣整齊、中央微凸起(見圖1中A)。在光學顯微鏡下觀察菌株呈短桿狀、單個或成對存在，無芽孢，革蘭氏染色為紫色呈陽性(見圖1中B)。

A B圖1 菌株LZ-2-12的形態特征 Fig.1 The morphological characteristics of strain LZ-2-12注：A為菌落形態；B為菌株形態(革蘭氏染色40x)

以菌株LZ-2-12的基因組DNA為模板，以細菌鑒定16S rDNA通用引物27F及1492R為引物進行PCR擴增，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2，擴增產物大小與預期結果相符，符合條件，純化后送測序公司進行測序。

圖2 菌株LZ-2-12的16S rDNA PCR擴增產物電泳圖 Fig.2 The electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplified products of strain LZ-2-12注：M為DL 2000 DNA Marker；1為菌株LZ-2-12；2為空白對照。

菌株LZ-2-12的16S rDNA序列經同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，構建系統發育樹。在GenBank的核苷酸BLAST比對結果表明，菌株LZ-2-12序列和植物乳桿菌Lactobacillusplantarumstrain 8187 序列同源性高達99.58%且與其在系統發育樹同一分支(見圖3)，結合形態學特征將其鑒定為植物乳桿菌Lactobacillusplantarum。

圖3 菌株LZ-2-12的系統進化分析 Fig.3 The phylogenetic analysis of strain LZ-2-12

2.4 降膽固醇菌株的發酵條件優化

2.4.1 碳源的優化

按照1.2.5的方法，用4種碳源分別作為培養基中唯一碳源培養LZ-2-12，分別在24 h和48 h取樣測定發酵液中的膽固醇含量，計算膽固醇降解率，分析它們作為唯一碳源對LZ-2-12降解膽固醇的影響，結果見圖4。

圖4 不同碳源對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.4 Effect of different carbon sources oncholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖4可知，不同的碳源作為唯一碳源對膽固醇降解率的大小為葡萄糖>乳糖>蔗糖>可溶性淀粉。通過事后檢驗，對碳源進行兩兩比較，分析顯著性差異，結果見表3。

表3 4種碳源間的差異性分析 Table 3 The difference analysis among four carbon sources

續 表

由表3可知，培養24 h時，除蔗糖與可溶性淀粉間無顯著性外(P>0.05)，其他均有顯著性差異(P<0.05)。培養48 h時，除蔗糖與乳糖無顯著差異外(P>0.05)，其他均有顯著性差異(P<0.05)。出現這種差異可能是碳源結構、單糖種類和糖苷鍵種類綜合影響的結果，葡萄糖作為單糖，可以直接被LZ-2-12利用，促進菌的生長，有利于對膽固醇的降解；蔗糖與乳糖均為二糖，不能直接被菌利用，需要被分解為單糖后才能被利用，故其降解膽固醇的效果次之；而蔗糖比乳糖利用慢，可能是糖苷鍵和糖苷差異的原因。可溶性淀粉屬于多糖，也不能被菌直接利用，被分解的效率更低，故其降解膽固醇的效果更差。

2.4.2 氮源的優化

按照1.2.5的方法，用4種氮源分別作為培養基中唯一氮源來培養LZ-2-12，分別在24 h和48 h取樣測定其發酵液中膽固醇的含量，計算膽固醇降解率，分析它們作為唯一氮源對LZ-2-12降解膽固醇的影響，結果見圖5。

圖5 不同氮源對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖5可知，不同的氮源作為唯一氮源的膽固醇降解率大小為細菌學蛋白胨>蛋白胨>胰蛋白胨>多聚蛋白胨。通過事后檢驗，對氮源進行兩兩比較，分析氮源間的顯著性差異，見表4。

表4 4種氮源間的差異性分析 Table 4 The difference analysis among four nitrogen sources

續 表

由表4可知，在培養的24 h和48 h后，細菌學蛋白胨作為唯一氮源的膽固醇降解率顯著大于其他3種氮源的膽固醇降解率，且均有顯著性差異(P<0.05)，因此細菌學蛋白胨是植物乳桿菌LZ-2-12降解膽固醇的最優氮源。

2.4.3 接種量的優化

將植物乳桿菌LZ-2-12分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%進行接種，在培養后的24 h和48 h取樣測定發酵液中膽固醇的含量，分析接種量對植物乳桿菌LZ-2-12降解膽固醇的影響，結果見圖6。

圖6 不同接種量對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖6可知，不同時期膽固醇降解率隨接種量的增加呈現先升高后降低的趨勢，在接種量為3%時達到最高。對它們進行兩兩比較，分析接種量間的顯著性，結果見表5。

表5 接種量間的差異性分析 Table 5 The difference analysis among the inoculation amount

續 表

由表5可知，培養24 h時，1%和2%接種量間的膽固醇降解率無顯著差異(P>0.05)，3%、4%和5%接種量間的膽固醇降解率兩兩無顯著性差異(P>0.05)，3%、4%和5%接種量的降解率顯著高于1%和2%接種量(P<0.05)。出現這種現象的原因可能是，植物乳桿菌LZ-2-12對膽固醇的降解與活菌數呈正比關系，在培養24 h時，1%與2%的接種量較低，生物量也低，因此降膽固醇降解率低；接種量超過3%時，接種量越大，培養基中的營養物質消耗越快，細菌活細胞數越低，導致膽固醇的降解率越低。培養48 h時,接種量為2%、3%和4%的膽固醇降解率顯著高于1%和5%(P<0.05)，隨著培養時間的延長，接種量間的膽固醇降解率差異逐漸縮小，但總體呈現接種量為3%時的膽固醇降解率為最佳。

2.4.4 pH的優化

將植物乳桿菌LZ-2-12分別在pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0下培養，在培養后的24 h和48 h取樣測定發酵液中膽固醇的含量，分析接種量對植物乳桿菌LZ-2-12降解膽固醇的影響，結果見圖7。

圖7 不同pH值對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.7 Effect of different pH values on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖7可知，當pH值在3.0～7.0之間時，菌株LZ-2-12的膽固醇降解率隨著pH的增加而增大；當pH值為7.0時，菌株LZ-2-12的降膽固醇能力達到最高，pH值大于7.0時，菌株LZ-2-12的膽固醇降解率隨pH值的增加而減小。兩兩比較pH間的差異顯著性，結果見表6。

表6 pH值間的差異性分析 Table 6 The difference analysis among the pH values

由表6可知，培養24 h時，pH 5.0，6.0，7.0間的膽固醇降解率無顯著性差異(P>0.05)，培養48 h時，pH 7.0的膽固醇降解率顯著高于pH 6.0和pH 7.0(P<0.05)。因此,中性環境有利于菌株LZ-2-12對膽固醇的降解，植物乳桿菌LZ-2-12代謝產生的酸環境不利于其對膽固醇的降解。

2.4.5 培養溫度的優化

將植物乳桿菌LZ-2-12分別在不同溫度下培養，在培養后的24 h和48 h取樣測定發酵液中膽固醇的含量，分析溫度對植物乳桿菌LZ-2-12對降膽固醇的影響，結果見圖8。

圖8 不同溫度對菌株LZ-2-12降膽固醇能力的影響Fig.8 Effect of different temperatures on cholesterol-reducing ability of strain LZ-2-12

由圖8可知，當溫度在22～37 ℃之間時，菌株LZ-2-12的降解率隨著溫度的升高而增大；當溫度為37 ℃時，菌株LZ-2-12的降膽固醇能力最佳，在24 h和48 h的膽固醇降解率分別為30.17%和39.97%；當溫度大于37 ℃時，菌株LZ-2-12的膽固醇降解率隨著溫度的升高而減小。兩兩比較不同溫度對膽固醇降解率的影響，結果見表7。

表7 溫度間的差異性分析 Table 7 The difference analysis among the temperatures

由表7可知，溫度為37 ℃時膽固醇降解率顯著高于32 ℃和42 ℃(P<0.05)，因此菌株LZ-2-12降解膽固醇的最佳溫度為37 ℃。

3 結論

本研究從柳州自然發酵酸筍中分離純化獲得一株降膽固醇能力較好的菌株LZ-2-12，經形態學觀察、分子生物學鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。該菌株在MRS培養基中生長良好，采用MRS培養基的其他組分及其濃度，以葡萄糖為唯一碳源(添加量為20 g/L)、細菌學蛋白胨為唯一氮源(添加量為10 g/L)、接種量為3%、pH值為7.0、溫度為37 ℃的條件下，最適合植物乳桿菌LZ-2-12對膽固醇的降解。該菌株源于廣西發酵酸筍，將其用于酸筍發酵具有安全性高的顯著特點，此外，該菌株在37 ℃和中性環境下降膽固醇效果較好，有在人體腸道定殖的良好基礎，該菌株的獲得在開發降膽固醇的功能性酸筍以及其他食品方面有良好的應用價值。