不同檢測方法在丙型病毒性肝炎診斷中的應用

劉麗花 徐昕

丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV）是單股正鏈RNA病毒，主要經血和血制品傳播。據流行病學分析，2015年全球HCV的感染率為2.8%，呈逐年上升趨勢[1]。丙型肝炎潛伏期與病程均較長，病情發展較為緩慢，疾病后期會導致患者出現肝臟慢性纖維化或者炎癥壞死等并發癥，由于HCV的病毒特性，患者感染病毒病程少見自限性痊愈，多遷延性發展為慢性丙型肝炎，10～20年之后發展為肝硬化，肝細胞肝癌，對患者生命安全造成威脅[2]。另外，丙型肝炎患者會由于肝細胞癌或者肝衰竭導致死亡，臨床尚無有效的預防與治療方法，需要通過早期檢測與干預來改善患者預后[3]。臨床檢測丙型病毒性肝炎所采用的方法主要有酶聯免疫法、磁微粒化學發光法、膠體金法及實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），對丙型肝炎病毒核糖核酸（hepatitis C virus-ribonucleic acid，HCV-RNA）載量與HCV抗體進行綜合檢測可對慢性丙型肝炎的感染情況進行明確，同時還可對病毒的復制情況進行判斷。HCV感染的病原學檢測是確定和治療決策的重要依據，本次研究旨在探討不同實驗室檢測方法在丙型病毒性肝炎臨床診斷中的應用，現總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2018年1月—2020年1月臨床診斷為丙型肝炎的患者100例，其中65例男性，35例女性；年齡最小25歲，最大76歲，平均年齡（50.52±6.53）歲；病程范圍0.3～1.2年，平均病程（0.75±0.25）年。詳見表1。臨床診斷標準參考《丙型肝炎防治指南（2015更新版）》[4]，所有入組患者均抽取靜脈血3～5 mL，常規分離血清后分裝保存于-20℃以下冰箱待冷凍保存備用。本研究經患者同意，經醫院倫理委員會批準。納入標準：（1）均簽署知情同意書；（2）均無肝炎史；（3）均存在厭油及右上腹部不適癥狀；（4）均具有完整的臨床資料。排除標準：（1）合并其他肝部疾病者；（2）依從性較低者；（3）存在意識障礙及認知障礙者；（4）存在精神障礙者。

1.2 方法

1.2.1 酶聯免疫法 采用Microlab STRA IVD酶免儀（瑞士澳斯邦生物工程有限公司，ELISA Star 8ch）其配套試劑進行檢測，采用間接法原理檢測人血清中的丙型肝炎病毒抗體。樣本A值＜臨界值（cut off）為丙型肝炎病毒-免疫球蛋白G（hepatitis virus C-immunoglobulin G，HCV-IgG）陰性，樣本A值≥臨界值（cut off）為HCV-IgG陽性。

1.2.2 磁微粒化學發光法 采用AutoLumo A2000 Plus全自動化學發光儀（鄭州安圖生物工程股份有限公司）以及全套試劑，所有操作嚴格按照試劑說明書進行，待測樣本發光值＜cut off值時，檢測呈陰性反應，待測樣本發光值≥cut off值時，檢測呈陽性反應，cut off值=陽性對照孔平均值×0.4。

1.2.3 膠體金法 采用膠體金免疫層析技術，應用間接法原理測定人血清中HCV抗體，15 min內觀察結果。HCV顯示陽性：試紙卡在檢測線（T）和對照線（C）位置出現兩條紫紅色條帶，陰性：試紙卡只在對照線（C）位置出現一條紫紅色條帶。

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用QIAamp Viral RNA miniKit核酸提取試劑盒提取病毒核酸，采用中山大學達安基因股份有限公司提供的HCV-RNA FQ-PCR試劑盒在ABI 7500儀器（美國羅氏公司，Light Cycler 480Ⅱ）進行檢測，所有操作嚴格按照試劑盒說明書及設備進行，將定量結果≥1×103IU/mL判定為陽性。

1.3 統計學方法

選用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，計量資料以（x-±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

磁微粒化學發光法陽性率為99.00%，酶聯免疫法陽性率為98.00%，略高于膠體金的94.00%，但三種檢測方法陽性率比較差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。實時熒光定量PCR法的陽性率為53.00%（53/100），主要用于檢測病毒載量。

表1 不同檢驗方法的檢驗結果比較[例（%）]

3 討論

丙型肝炎是由HCV感染引起的一系列肝功能異常、損傷、甚至肝癌的一類傳染性疾病，發病率較高且逐年上升，對患者身體健康有嚴重影響，甚至威脅到其生命安全，已成為非常嚴重的公共衛生問題[5]。丙型肝炎的病程相對較長且轉陰率較低，目前對丙型肝炎的發病機制并不十分明確。有研究認為HCV的直接損傷是急性丙型肝炎的主要病因，宿主免疫的損傷作用可能與慢性丙型肝炎的發病機制有關，特異性體液免疫及細胞免疫可能發揮了重要作用[6]。患者發病早期無明顯癥狀，也未出現相關不適感，極易被忽視，患者甚至不愿意入院接受檢查，隨著病情進展患者病情逐漸加重，導致其錯過最佳治療時間，增大治療難度，一旦漏診或者誤診會導致患者出現肝硬化與肝癌等惡性并發癥，甚至導致患者死亡[7]。當前尚無治療丙型肝炎的特效疫苗或者方式，在早期預防方面存在較大難度，由于該病具有傳染性，盡早實施有效診斷可降低發病率，控制病情進展，改善患者預后，因此早期診斷對疾病治療意義重大[8]。

丙型肝炎主要由丙型肝炎病毒所導致，病毒進入人體之后會出現病毒血癥，丙型肝炎病毒還會對細胞內大分子的合成造成干擾，導致溶酶體膜通透性發生變化，引起細胞病變。就肝細胞來說，丙型肝炎病毒表達物所產生的毒性作用不但會損傷患者肝臟，還會損害其他臟器功能。臨床尚無預防丙型肝炎的有效疫苗，健康人群可通過體檢篩查來預防疾病發生，及時發現并且及時治療，進而有效預防疾病的發生。對丙型肝炎的診斷首先需要對抗-HCV抗體及HCV核糖核酸等標志物進行檢驗，若以上標志物的檢驗結果為陽性，可將其確診為丙型肝炎。另外，還要通過肝臟功能的超聲檢驗與生化檢驗等方式與診斷標準相結合，進而確定丙型肝炎。丙型肝炎的傳染源較為復雜，主要為無癥狀亞臨床患者、急性臨床患者、慢性患者與病毒攜帶者，一般情況下，患者在發病前12 d其血液就存在感染性，并且病毒可攜帶12年以上，主要傳播途徑為血源傳播，國外輸血之后確診為丙型肝炎的人數在30%～90%之間，我國輸血之后確診為丙型肝炎的患者在所有肝炎人群中占有1/3，其他傳播方式如家庭日常接觸傳播、母嬰垂直傳播及性傳播。輸入含有HCV-RNA或者HCV的血液制品或者血漿之后，一般情況下需要經過6～7周的潛伏期后可急性發病，患者主要臨床表現為肝區不適、全身無力及胃納差，約1/3患者會出現黃疸、ALT升高及抗HCV抗體陽性，大約50%的丙型肝炎患者會逐漸發展為慢性肝炎，部分患者甚至會發展為肝硬化與肝細胞癌，半數患者屬于自限性，可自動康復。該病的發病機理尚未完全清楚，HCV在細胞內復制會對肝細胞蛋白的合成造成干擾，甚至會導致肝細胞功能與結構發生變化，導致肝細胞變性壞死，可見HCV會對患者肝臟造成直接損害，對于疾病的發生有促進作用。患者一旦感染HCV，產生的保護性免疫力相對較差，在急性感染之后血液中首先發現HCV-RNA，之后才會發現抗HCV，并且最早對HCV-RNA的檢出時間為暴露后2周。

完善的病原學檢測是慢性HCV感染篩查、監測、診斷和治療的基礎。酶聯免疫法是臨床應用廣泛的丙型肝炎檢測方法，也是應用最早的檢測方法，主要通過酶催化且放大反應效果的方式進行檢測，雖然陽性率較高，但操作較為繁瑣，需要進行批量檢測，所花費的資金較多。在醫療技術不斷發展的情況下，新的檢測技術在臨床廣泛應用，相對于酶聯免疫法這種操作復雜且價格昂貴的檢測來說，研究人員更傾向于簡單、便捷且高效的檢測方法[9-10]。磁微粒化學發光法是先進的技術手段，所用時間較短，可自動進行稀釋并重新檢測，準確率較高。膠體金法在丙型肝炎的檢測中得到廣泛應用，主要將抗體與抗原之間的反應通過層析法進行檢測，采用膠體金判斷陽性與陰性可使得檢測準確率不斷提高，漏診率與誤診率不斷降低，并且該種檢測方式操作簡便快捷，不需要特殊設備即可完成檢驗，可用于初步診斷，對丙型肝炎的預防與控制方面具有較高的應用價值[11-12]。熒光定量PCR法是近年發展的生物學檢測技術，主要是在常規的PCR技術中應用熒光探針或者熒光染料，然后通過累積的熒光信號對整個PCR過程進行監測，之后對其進行定量分析，可很好的彌補其他檢測方式存在的弊端，定量準確率高可真實反映HCV的復制情況，但檢查繁瑣且費用昂貴。研究中酶聯免疫法的檢測陽性率為98.00%，磁微粒化學發光法的檢測陽性率為99.00%，兩種檢測方法的檢測陽性率之間無顯著差異（P＞0.05），表明對丙型肝炎的檢測均有顯著的臨床效果。膠體金法的檢測陽性率為94.00%，主要用于初篩實驗[13]。三種方法之間差異無統計學意義（P＞0.05）。實時熒光定量PCR法的檢測陽性率為53.00%，現主要用于已確診的HCV感染患者的病毒載量。

HCV-IgG是反映是否感染過HCV的指標，對慢性肝炎的診斷有重要意義。HCV-RNA是HCV感染的直接證據，為確診丙型肝炎，監測病毒水平，確定治療方案和抗病毒療效觀察提供依據。

綜上所述，綜合檢測HCV抗體和HCV-RNA載量可以明確診斷慢性丙型肝炎感染和判斷病毒復制情況。