利用基因組編輯和相關(guān)技術(shù)加速癌癥科學(xué)的發(fā)展

摘要：基因組編輯包括基因組的各種編輯，如短插入和短刪除、替換和染色體重排，包括逆序、重復(fù)和易位。這些變異是基于單鏈或多鏈DNA雙鏈斷裂（DSB）觸發(fā)的細(xì)胞修復(fù)機(jī)械。除了這些傳統(tǒng)的基因組編輯策略之外，能夠?qū)μ囟ê怂嵝蛄羞M(jìn)行自定義、位點(diǎn)特異性識(shí)別的工具也得到了更廣泛的應(yīng)用：如不引入DSB的單堿基編輯、添加表觀遺傳學(xué)修飾劑的表觀基因組編輯、使用RNA編輯系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組工程、特異DNA和RNA序列的體外檢測(cè)等。在這篇綜述中，我們簡(jiǎn)要介紹了基因組編輯和相關(guān)技術(shù)的現(xiàn)狀，這些技術(shù)為癌癥科學(xué)做出了多方面的貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞：基礎(chǔ)編輯;癌癥科學(xué);CRISPR-Cas9;基因組編輯;轉(zhuǎn)錄組編輯;

【中圖分類號(hào)】R246.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）05-124-03

Abstract：Genome editing includes various edits of the genome， such as short insertions and deletions， substitutions and chromosomal rearrangements including inversions， duplications and translocations. These variations are based on single or multiple DNA double-strand break （DSB）-triggered in cellulo repair machineries. In addition to these “conventional” genome editing strategies， tools enabling customized， site-specific recognition of particular nucleic acid sequences have been coming into wider use： for example， single base editing without DSB introduction， epigenome editing with recruitment of epigenetic modifiers， transcriptome engineering using RNA editing systems， and in vitro detection of specific DNA and RNA sequences. In this review， we provide a quick overview of the current state of genome editing and related technologies that multilaterally contribute to cancer science.

Key words： base editing; cancer science; CRISPR-Cas9; genome editing; transcriptome editing;

1.介紹

基因的定義是遺傳信息的一個(gè)單位，這是一個(gè)相當(dāng)概念化的術(shù)語(yǔ)。在活細(xì)胞中，有編碼基因和非編碼基因，分別作為蛋白質(zhì)和RNA發(fā)揮作用。基因可以在體外用于各種目的，包括無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯的創(chuàng)造，以及遺傳疾病、癌癥和傳染病的診斷。

基因組編輯工具可以設(shè)計(jì)具有可定制DNA結(jié)合和裂解特性的基因，這些特性適用于活細(xì)胞和有機(jī)體。它們對(duì)于基因組DNA的序列改變無(wú)疑是有用的，可以進(jìn)行簡(jiǎn)單的基因敲除和敲入，也可以進(jìn)行更為復(fù)雜的編輯。然而，考慮到上述基因的眾多特點(diǎn)，基因的編輯技術(shù)也變得多樣化。事實(shí)上，在過(guò)去的幾年中，各種方法和技術(shù)得到了迅速發(fā)展、改進(jìn)，并以各種方式得到了應(yīng)用。

2.基因組編輯的衍生技術(shù)

由于基因組編輯領(lǐng)域技術(shù)的飛速發(fā)展，使得該領(lǐng)域的研究很難保持與時(shí)俱進(jìn)。到目前為止，已有課題組發(fā)表了許多關(guān)于基因組編輯的評(píng)論，其中包含了每次發(fā)表時(shí)可以獲得的最新信息。例如，大綱的這項(xiàng)技術(shù)包括歷史背景綜述了2014年，集中審查CRISPR-Cas9于2015年出版[1]，以及轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子（TALE）核酸酶（TALEN）系統(tǒng)的全面概述[2]。在這些回顧中，介紹了各項(xiàng)技術(shù)發(fā)展成就包括高度活躍的TALE/TALEN變體，名為Platinum TALE/TALEN。

之前報(bào)道了一些重要的創(chuàng)新，如具有更廣泛PAM特異性的xCas9， HypaCas9和橋接核酸結(jié)合CRISPR RNA[3]用于超準(zhǔn)確的DNA識(shí)別，以及Cas9-HE用于高效的同源依賴修復(fù)。此外，在2018年開(kāi)發(fā)的DSB修復(fù)分子（LoAD）局部積累系統(tǒng)，該系統(tǒng)支持修復(fù)通路偏向的基因組編輯[4]。在轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）系統(tǒng)中，傳統(tǒng)的TALEN包含恒定重復(fù)，沒(méi)有非重復(fù)可變雙殘基（非RVD）變異而該課題組改良的TALEN包含非RVD變異的可變重復(fù)，導(dǎo)致更高的核酸酶活性。

3. 技術(shù)理論

3.1 單堿基對(duì)編輯

堿基編輯是一種較新的基因組編輯方法，它使用CRISPR系統(tǒng)的組件和其他酶直接將點(diǎn)突變安裝到細(xì)胞DNA或RNA中，而不會(huì)造成雙鏈DNA斷裂。

單堿基對(duì)編輯是一種用于疾病建模和校正的基因組序列的精細(xì)而重要的修飾方法。各種依賴于DBS介導(dǎo)的傳統(tǒng)基因組編輯的復(fù)雜策略已經(jīng)被報(bào)道并且在這一領(lǐng)域正在不斷發(fā)展。最近的一個(gè)例子是微同源介導(dǎo)的末端連接（MMEJ）依賴策略，稱為MhAX[5]，實(shí)現(xiàn)了一種MMEJ依賴的基因編輯策略，稱為音高系統(tǒng)，在盒式磁帶切除。

單堿基對(duì)編輯的基本概念是胞嘧啶脫氨酶介導(dǎo)胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，然后是胸腺嘧啶。胞苷脫氨酶，如APOBEC1，與dCas9或Cas9n （Cas9 nickase）結(jié)合，靶向特定的基因組位點(diǎn)。單堿基對(duì)編輯系統(tǒng)的適用性最初在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被證實(shí)[6]，然后是各種生物體，包括植物，老鼠，海膽和細(xì)菌[7]。

3.2 全基因組篩查

基因組編輯核酸酶通常用于逆向遺傳學(xué)，但《科學(xué)與自然生物技術(shù)》上發(fā)表的三篇里程碑式論文開(kāi)創(chuàng)了CRISPR介導(dǎo)的正向遺傳學(xué)的新時(shí)代[8]，慢病毒RNAi篩選系統(tǒng)被CRISPR-Cas9所取代。將全基因組慢病毒單指南RNA（sgRNA）文庫(kù)匯集并感染培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行預(yù)期的抗腫瘤藥物耐藥性，并通過(guò)下一代測(cè)序分析富集的sgRNA。近年來(lái)，基于CRISPR/ Cas9的聯(lián)合篩選方法迅速改變了功能基因組學(xué)領(lǐng)域。突變體的容易產(chǎn)生、較低的靶外效應(yīng)和Cas9蛋白的工程通用性通常使全基因組CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的篩選優(yōu)于大規(guī)模的RNAi篩選。

在癌癥科學(xué)的背景下，以下強(qiáng)調(diào)使用全基因組篩選的幾個(gè)關(guān)鍵研究。第一項(xiàng)研究是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的體外篩選 [9]，分被引入非轉(zhuǎn)移性小鼠癌細(xì)胞，然后移植到成年小鼠中，篩選腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)突變。第二項(xiàng)研究是一系列報(bào)道長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）篩選的研究。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了lncRNAs的多樣性，并推測(cè)數(shù)千個(gè)lncRNAs與人類疾病有關(guān)[10]。

匯集的全基因組篩選雖然有助于推斷生物功能，但不能根據(jù)其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)提供關(guān)于細(xì)胞狀態(tài)的詳細(xì)信息。在傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9合用屏幕上，讀出的只是細(xì)胞池中包含的大量gRNA序列，無(wú)法有效地提供所需的分辨率來(lái)進(jìn)行綜合表型。

3.3 DNA條碼和記錄

正如已經(jīng)介紹過(guò)的那樣，具有反向和正向遺傳學(xué)的基因組編輯顯著促進(jìn)了癌癥的特征描述;然而，從臨床腫瘤學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，癌癥進(jìn)化所產(chǎn)生的大量突變使事情變得極其復(fù)雜。們將獲得一個(gè)強(qiáng)大的武器來(lái)應(yīng)對(duì)這一巨大的挑戰(zhàn)，它們可以大致分為兩種策略：DNA條碼和記錄。

格式塔法將條形碼整合到能夠引入多種突變模式的基因組中，實(shí)現(xiàn)了斑馬魚(yú)的整個(gè)有機(jī)體譜系追蹤[11]。通過(guò)測(cè)序分析了條形碼中獨(dú)立引入和進(jìn)化的突變模式，從而實(shí)現(xiàn)了譜系追蹤。

3.4 轉(zhuǎn)錄控制和表觀基因組編輯

雖然每一種方法都是可變的，但是上面介紹的所有技術(shù)都伴隨著DNA序列的改變。相反，控制基因表達(dá)或操縱表觀遺傳修飾也可以在不改變DNA序列的情況下調(diào)節(jié)表型。

首先，之前報(bào)道的整合的多倍腺病毒CRISPRi載體，同時(shí)攜帶融合了轉(zhuǎn)錄抑制域、KRAB和多個(gè)sgRNA的dCas9，在培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)有效地顯示了抗腫瘤作用。其次，以TALE為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾因子也是該領(lǐng)域很有前途的工具。相關(guān)研究表明，只要加入一種與轉(zhuǎn)錄激活域和細(xì)胞穿透肽融合的重組鉑層蛋白，就可以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的重編程[12]。

3.5 其他新興技術(shù)：RNA靶向和編輯、基于CRISPR的診斷和鄰近標(biāo)記

在轉(zhuǎn)錄組編輯和體外診斷方面，RNA引導(dǎo)的RNA靶向酶Cas13是一個(gè)值得關(guān)注的系統(tǒng)。據(jù)報(bào)道，Cas13可用于基因敲除和靶向RNA結(jié)合，用于轉(zhuǎn)錄的活細(xì)胞跟蹤。通過(guò)使用其他Cas蛋白質(zhì)如CsrX顯示了類似的應(yīng)用。Cas13進(jìn)一步被用于病毒核酸的診斷和無(wú)細(xì)胞DNA的癌癥檢測(cè)。最初的系統(tǒng)被稱為SHERLOCK，它能夠從數(shù)量有限的靶DNA和RNA中進(jìn)行低成本、高靈敏度和魯棒的檢測(cè)[13]。

GloPro和C-BERST均可實(shí)現(xiàn)dCas9-APEX介導(dǎo)的靶向基因組DNA區(qū)域鄰近標(biāo)記，用于位點(diǎn)特異性蛋白組學(xué)[14]。之前的系統(tǒng)稱為工程染色質(zhì)免疫沉淀（enChIP），其基礎(chǔ)是標(biāo)記的dCas9介導(dǎo)的沉淀[15]; 然而，這些新系統(tǒng)在生物素-苯酚和H2O2存在的情況下，僅通過(guò)sgRNA表達(dá)dCas9-APEX，很容易對(duì)近端蛋白進(jìn)行生物酰化。這些技術(shù)還應(yīng)該有助于癌癥相關(guān)基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

4.結(jié)論

我們相信，DSB介導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)基因組編輯是一項(xiàng)改變世界的技術(shù)，毫無(wú)疑問(wèn)，它極大地改變了包括癌癥科學(xué)在內(nèi)的生命科學(xué)研究。然而，除此之外，許多新技術(shù)目前正在等待機(jī)會(huì)來(lái)創(chuàng)建一個(gè)范式轉(zhuǎn)移（或者可能是多個(gè)范式轉(zhuǎn)移）。為了充分利用這些新興技術(shù)，我們必須密切關(guān)注它們。

在另一方面，最近的調(diào)查警告了在應(yīng)用CRISPR-Cas9時(shí)發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)、意外的異質(zhì)性和可變的目標(biāo)編輯結(jié)果。隨著基因組編輯應(yīng)用的急劇增加，安全問(wèn)題變得越來(lái)越重要。

參考文獻(xiàn)：

[1]KUMA T， YAMAMOTO T. Crispr/cas9： the leading edge of genome editing technology[J]. Targeted Genome Editing Using Site-specific Nucleases， 2015， 7： 25-41.

[2]SAKUMA T， YAMAMOTO T. Current overview of TALEN construction systems. Methods In Molecular Biology， 2017， 1630： 25-36.

[3]NAKADE S， YAMAMOTO T， SAKUMA T. Cas9， Cpf1 and C2c1/2/3-what’s next [J].Bioengineered， 2017， 8： 265-273.

[4]NAKADE S， MOCHIDA K， KUNII A， et al. Biased genome editing using the local accumulation of DSB repair molecules system[J]. Nature Communications ， 2018， 9： 3270-3280.

[5]KIM S I， MATSUMOTO T， KAGAWA H， et al. Microhomology-assisted scarless genome editing in human iPSCs[J]. Nature Communications ， 2018， 9： 939-952.

[6] KOMOR A C， KIM Y B， PACKER M S， et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage[J]. Nature， 2016， 533： 420-424.

[7]SHIMATANI Z， KASHOJIYA S， TAKAYAMA M， et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion[J]. Nature Biotechnology， 2017， 35： 441-443.

[8]WANG T， WEI J J， SABATINI D M， et al. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system[J]. Science， 2014， 343： 80-84.

[9]CHEN S， SANJANA N E， ZHENG K， et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis[J]. Cell， 2015， 160： 1246-1260.

[10]HON C C， RamilowskiAMILOWSKI J A， HARSHBARGER J， et al. An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5′ ends[J]. Nature， 2017， 543： 199-204.

[11]MCKENNA A， FINDLY G M， GAGNON J A， et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing[J]. Science， 2016l， 353： 1-17.

[12]TAKASHINA T， KOYAMA T， NOHARA S， et al. Identification of a cell-penetrating peptide applicable to a protein-based transcription activator-like effector expression system for cell engineering[J]. Biomaterials， 2018， 173： 11‐21.

[13]GOOTENBERG J S， ABUDAYYEH O O， LEE J W， et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science， 2017， 356： 438-442.

[14]MYERS S A， WRIGHT J， PECKNER R， et al. Discovery of proteins associated with a predefined genomic locus via dCas9-APEX- mediated proximity labeling[J]. Nature Methods， 2018， 15： 437-439.

[15]FUJITA T， FUJII H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation （enChIP） using CRISPR[J]. Biobiochemica and Physalic Research Communication， 2013， 439： 132-136.

作者簡(jiǎn)介：周瑜，女，漢，1994年3月生，重慶人，碩士研究生，學(xué)生（西南民族大學(xué)，青藏高原研究院，遺傳學(xué)專業(yè)，2018級(jí)），研究方向：分子遺傳學(xué)與基因工程。

西南民族大學(xué)，四川 成都? 610041