生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應

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摘要：生物酶是一種具有專一性、特異性以及催化效率高的綠色催化劑。將其應用于工業生產之中不僅可以極大的提升工業生產效率而且可以有效避免環境污染，提高企業競爭優勢。但是生物酶對使用環境的要求較高，因此如何實現低成本、高效率的應用生物酶是工業催化研究的熱點之一。本文對生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應進行研究，以探討生物酶的工業化應用。

關鍵詞：生物酶;催化作用;不飽和脂肪酸;硝化反應

1.生物催化硝化反應

相比于化學催化作用，生物酶催化作用具有專一性、特異性以及高效性的特點，且不會對環境造成污染，因此，隨著生物科學研究的進步，在工業化學合成領域中的應用越來越廣泛。由于發現3-NT蛋的硝化產物存在于人和動物的患病組織中，并且證明其中一些與過氧化物酶有關，這引起了人們對生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應的研究，過氧化物酶是一種氧化還原酶，廣泛存在于生物體中，其主要是使用過氧化氫作為電子受體來催化底物的氧化的生物酶，并通過血紅素作為次要基礎來參與體內細胞的代謝。隨著生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應研究的深入，過氧化物酶在環境、臨床、食品加工和分析化學行業中起著越來越重要的作用。大量實驗已證實過氧化物酶可以催化可以在溫和條件下以高收率和高選擇性催化生產硝基苯酚類物質。因此，過氧化物酶催化的硝化反應的不斷深入研究和使用無疑將在未來生物學和化學相關領域取得重要進展。

2.酶在納米級的固定化

酶的固定化是工業應用中高效利用酶的必要方式，其主要指的是通過特定方法將水溶性酶轉化為不溶與水且以固態形式存在的活性物質。相比于生物體內的游離酶而言，酶的固定化優勢很大，不僅可以方便與底物產物相互分離實現生物酶的回收利用，降低生物酶的使用成本，而且可以提高對催化反應進程的控制，保證催化反應的穩定進行。在酶的固定化中，固定化載體材料是基礎，對于酶的各類性能影響較大，因此是酶的固定化研究的重點。隨著納米科學的進展，當前，用于固定化酶的載體材料已開始從最早的天然聚合物材料發展為合成聚合物材料，無機材料和復合材料。

3.生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應

3.1硝基不飽和脂肪酸及其生理意義

不飽和脂肪酸是之所以被稱為不飽和脂肪酸是因為具有碳雙鍵結構，根據碳雙鍵結構的數量分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。油酸（十八碳-順-9-烯酸）是典型的單不飽和脂肪酸，又稱紅油，在室溫下為無色，無味，高粘度液體，不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、苯等有機溶劑。

硝基油酸是通過硝化反應改性的生物活性物質，其中碳雙鍵上的一個氫被硝基取代，并且烴鏈中的雙鍵不被破壞，因此被稱為硝基不飽和脂肪酸。對人體血漿和尿液的分析表明，人體富含硝基不飽和脂肪酸，其中，硝基油酸含量最高，研究最廣泛。硝基不飽和脂肪酸的生理作用主要體現在以下三個方面：（1）硝基不飽和脂肪酸可以強烈激活被過氧化物酶增殖劑激活的γ受體（在非常低的生理濃度下可以激活），但對PPARβ和PPARβ的作用稍弱（激活需要300nM）。（2）硝基不飽和脂肪酸在體內也起NO供體的作用，在疏水環境中穩定，但在極性環境中會分解和釋放NO。（3）硝基不飽和脂肪酸可用作細胞信號傳遞的介體并表現出親電特性，利用烷基化NF-KB蛋白質家族p65亞基的，防止其滲透到核中并促進相關炎癥基因的結合，參與基因轉錄和蛋白質表達，抑制腫瘤壞死因子和脂多糖誘導的促炎細胞因子在巨噬細胞和內皮細胞中的分泌，從而發揮一定的抗炎作用。此外，硝基不飽和脂肪酸還顯示出強大的Nrf2/Keap1活化作用。

3.2硝基不飽和脂肪酸的化學合成

硝基不飽和脂肪酸廣泛存在于生物體內，沒有任何毒副作用，且生物活性非常高。如果可以通過一定的方式在體外快速有效地合成，則可以極大的促進其工業應用。但是，目前關于體外合成硝基油酸及其衍生物的研究報告較少，主要包括化學合成和酶促合成兩種類型的硝基油酸，如下幾種合成方式：

（1）使用油酸作為原料與氯化汞（HgCl2），溴化苯基硒和亞硝酸鈉（NaNO2）以一定比例反應，反應產物被H2O2氧化和脫水，形成粗硝基油酸。然后使用多種分離和檢測方法獲得具有兩個位置異構體（9-硝基和10-硝基）的純硝基油酸。該方法已申請美國專利，但該方法使用劇毒的合成材料，對環境有害。

（2）通過環辛烯在8步反應中合成9-硝基-18烷-9-烯酸，然后使用壬二酸單甲酯作為起始原料在9步反應中制備10-硝基-18烷-9-烯酸。但是，由于反應步驟太復雜，產物收率很低，工業化效益不足需要進一步研究。

（3）以油酸甲酯為原料，在酸性環境中與NaNO2反應可以獲得四種類型的硝基烯烴化合物，因此需要分幾個階段進行純化。

（4）以油酸為原料，使油酸、過氧化物酶（MPO），NaNO2和H2O2在磷酸鹽緩沖液中按一定比例反應，并以規則的間隔逐滴添加定量的H2O2到混合物中。反應后，分離并純化，得到產物。這種方法產生了較多多的含有硝基醇結構的副產物。

（5）以油酸甲酯為原料，通過生物學方法過氧化物酶作為合成亞油酸甲酯的催化劑，產物非常純凈，幾乎沒有副產物，硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產物的形成。

3.3生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應

以大豆過氧化酶為基礎，利用磷酸銅納米花載體結構固定化酶，探索生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應。結果表明，硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產物的形成，提高反應效率，促進生物酶催化不飽和脂肪酸的工業生產應用。

（1）通過大豆皮提取大豆過氧化物酶，并進行提純。利用單因素實驗和正交實驗法獲取最佳工藝條件。并通過硫酸銨分級沉淀和丙酮分級沉淀進行提純。相關試驗表明，最佳工藝條件為料液比1：8、溫度35℃、周期24h;硫酸銨分級沉淀飽和度范圍為30%-80%;丙酮分級沉淀體積倍數范圍為0.4-1.2。

（2）以（1）中提取的大豆過氧化酶為基礎，利用磷酸銅納米花載體結構固定化酶。并測試酶活性，將其與游離酶活性進行相比，發現該結構可以有效提高酶活性，增強強度為446%。且就可以進行循環多次利用，試驗表明經過5次循環利用任具有80%的生物活性。

（3）以油酸為原料，分別以化學法和生物法合成硝酸油酸。通過紅外光譜、核磁共振和液相質譜法對所得產物進行測試，以研究固定化酶的作用。結果表明硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產物的形成，值得繼續深入研究以實現工業化應用。

本實驗證明，化學法和生物法都可以以油酸為原料生產硝基油酸，但是化學合成法的副產物較多，需要多次純化工藝。而硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產物的形成，但其研究仍需要進一步完善。

結束語：

納米結構固定化載體可以固定化酶，最大化酶活性的基礎上提高其利用效率，通過固定化酶應用與生物催化可以有效促進生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應，并將其與化學合成領域結合起來，促進生物催化和化學合成相結合的進一步發展。

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