光譜校正在遺傳測(cè)序儀操作中的應(yīng)用

趙世鵬 張雪萍 王相輝

(濰坊眾誠(chéng)司法鑒定所，山東 濰坊 261000)

1 法醫(yī)物證鑒定

1.1 法醫(yī)物證鑒定技術(shù)

法醫(yī)物證鑒定是指鑒定人運(yùn)用法醫(yī)物證學(xué)的科學(xué)技術(shù)或者專門知識(shí)，對(duì)各類生物檢材進(jìn)行鑒別和判斷并提供鑒定意見(jiàn)的活動(dòng)。法醫(yī)物證鑒定技術(shù)發(fā)展迅速，不僅能夠在偵查中提供偵查線索，而且能在法院審判過(guò)程中作為判決依據(jù),在司法領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，在司法實(shí)踐中發(fā)揮著前所未有的重要作用。

基因測(cè)序是法醫(yī)物證鑒定的核心技術(shù)。從1977 年的第一代Sanger 測(cè)序技術(shù)發(fā)展至今，基因測(cè)序已經(jīng)有40 年的發(fā)展歷史。1987 年，基于Sanger 測(cè)序原理Applied Biosciences 公司發(fā)布第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀，第一代測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)，準(zhǔn)確率高，后來(lái)成為人類基因組計(jì)劃的主力機(jī)型，現(xiàn)在依然是測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)。第一代測(cè)序雖然準(zhǔn)確度高，但是存在成本大、通量低等缺點(diǎn)，制約其廣泛應(yīng)用。經(jīng)過(guò)改進(jìn)，以羅氏454、illumina、Life 的Solid 系統(tǒng)為主的第二代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)，促使測(cè)序成本以超摩爾定律下降，測(cè)序速度大幅提高。第三代測(cè)序技術(shù)是單分子測(cè)序，由于不需要對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增等前期準(zhǔn)備工作，測(cè)序時(shí)間大幅縮小，理論準(zhǔn)確性將提高，成本進(jìn)一步下降，相比于二代測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，但是由于準(zhǔn)確性低、測(cè)序信號(hào)易丟失等問(wèn)題，目前尚在科研階段。

二代基因測(cè)序儀是目前法醫(yī)物證鑒定中使用的主要設(shè)備，其應(yīng)用的主要技術(shù)為毛細(xì)管凝膠電泳與熒光檢測(cè)[1]。

電泳的定義：利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。傳統(tǒng)電泳(瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等)通常需要制膠、上樣、分離、染色/脫色等操作，過(guò)程冗長(zhǎng)，不適合定量分析，而且在電泳分離過(guò)程中，焦耳熱的產(chǎn)生使電解質(zhì)溶液的密度發(fā)生變化，導(dǎo)致分離度下降。1983，Hjerten將聚丙烯酰胺凝膠電泳移植，制成了毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)，使得DNA 片段分離在毛細(xì)管電泳中成為可能。隨后高效毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，高效毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以樣品的電荷、大小、形狀等多種特性為根據(jù)的分離技術(shù)。

熒光檢測(cè)原理：熒光是染料分子并檢測(cè)染料被激發(fā)后產(chǎn)生的光，能夠發(fā)射熒光的分子叫熒光基團(tuán)，是具有不同形狀、大小和發(fā)光能力的分子。用于DNA 標(biāo)記的熒光基團(tuán)發(fā)射光的波長(zhǎng)一般在400－600nm 的范圍內(nèi)。熒光的發(fā)光過(guò)程分三步，首先激發(fā)光源發(fā)出一個(gè)光子將熒光基團(tuán)從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)，然后該熒光基團(tuán)構(gòu)象變化及與環(huán)境作用后進(jìn)入單一激發(fā)態(tài)，最后激發(fā)態(tài)的電子發(fā)出一個(gè)能量較低的光子并回到基態(tài)。吸收光譜與發(fā)射光譜峰的頂點(diǎn)之間產(chǎn)生一個(gè)差值稱為司多克斯遷移。使用光譜過(guò)濾將激發(fā)光和發(fā)射光區(qū)別開(kāi)，并且通過(guò)發(fā)射光譜的區(qū)別可以選擇不同的熒光基團(tuán)，這種特性的存在使利用多種熒光基團(tuán)同時(shí)檢測(cè)不同的DNA 分子稱為可能。熒光基團(tuán)發(fā)光效率會(huì)受到摩爾消光系數(shù)、量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性、染料環(huán)境的綜合作用影響。激光轟擊熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)吸收激光能量，然后發(fā)出較低能量(較大波長(zhǎng))的光，用濾光片僅收集特定波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光，用電偶合裝置收集和放大來(lái)自熒光基團(tuán)的信號(hào)，并把它轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。用相對(duì)熒光強(qiáng)度單位計(jì)量信號(hào)，生成毛細(xì)管電泳圖。不同熒光染料發(fā)射光譜的不同，不同位點(diǎn)的引物用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，使不同位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物帶有不同的熒光標(biāo)記，檢測(cè)儀器發(fā)射特定波長(zhǎng)激光，激發(fā)熒光分子使其發(fā)射特定波長(zhǎng)范圍的光，儀器收集該發(fā)射熒光，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，收集軟件將信號(hào)以掃描峰的形式顯現(xiàn)出來(lái)。[2]

1.2 光譜校正的原理(圖1-2)

圖1

在ABI310 上最初稱謂是Matrix 校正，在多毛細(xì)管系統(tǒng)上稱為光譜校正。光譜校正主要是解決光譜空間到染料空間的映射問(wèn)題。不同的熒光染料其發(fā)射光譜一般會(huì)部分重疊，也可以說(shuō)光譜校正就是修正不同染料發(fā)射光譜之間疊加的一個(gè)數(shù)學(xué)矩陣。多色熒光檢測(cè)需要檢測(cè)四到五種熒光分子在其中心發(fā)射波長(zhǎng)處的信號(hào)。由于每種熒光分子的發(fā)射光譜不是銳線光譜，而是有一定寬度分布的光譜帶，所以一種純熒光分子除在它自己的中心波長(zhǎng)處能采集到信號(hào)外，在其他熒光分子的中心波長(zhǎng)處也能檢測(cè)到信號(hào)，導(dǎo)致信號(hào)重疊。為了消除這些重疊的信號(hào)，需要知道每種熒光信號(hào)在其他熒光信號(hào)處的重疊系數(shù)。所以，用分別標(biāo)記有不同熒光分子的四(或五)條不同長(zhǎng)度的DNA 片斷(即光譜校正標(biāo)準(zhǔn)品)來(lái)測(cè)定這些系數(shù)，得到一個(gè)4×4(或5×5)的矩陣。進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，軟件會(huì)自動(dòng)將收集到的樣品數(shù)據(jù)與光譜進(jìn)行比較；通過(guò)比較，每個(gè)色道其他染料產(chǎn)生的信號(hào)將被扣除，因此補(bǔ)償了光譜間的疊加。[3]通過(guò)分析光譜校正的標(biāo)準(zhǔn)品，數(shù)據(jù)收集軟件利用數(shù)學(xué)矩陣進(jìn)行計(jì)算，使每一種被校準(zhǔn)的染料在多通道毛細(xì)管測(cè)序儀上呈現(xiàn)單一峰形。

圖2

2 光譜校正的實(shí)際應(yīng)用

2.1 測(cè)序儀何時(shí)需進(jìn)行光譜校正(圖3)

圖3 基線不平，需進(jìn)行光譜校正

建立與熒光染料相適應(yīng)的光譜校正，能夠防止發(fā)生相鄰染料通路之間的滲透，STR 試劑盒生產(chǎn)商都會(huì)提供與試劑盒標(biāo)記引物熒光染料相同的特定DNA 樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品。不同的STR 試劑盒有不同的染料組合，在測(cè)序時(shí)，相應(yīng)的STR 試劑盒必須用與之相匹配的染料組合進(jìn)行光譜校正，否則將不能正常的收集數(shù)據(jù)。染料標(biāo)記的DNA 分子數(shù)量過(guò)多時(shí)，飽和的CCD 檢測(cè)信號(hào)也會(huì)產(chǎn)生拔起現(xiàn)象。在實(shí)際操作中，遇到以下幾種情況時(shí)，通常需要對(duì)儀器進(jìn)行光譜校正：(1)使用新的熒光染料組合；(2)激光或CCD 被調(diào)節(jié)或更換后；(3)參數(shù)改變、更換毛細(xì)管或者調(diào)整光路后；(4)不同顏色的熒光間出現(xiàn)干擾(有拔起或下壓峰)，檢測(cè)圖譜基線不平，峰形明顯異常。

2.2 如何進(jìn)行光譜校正操作及評(píng)價(jià)(圖4)

圖4 光譜校正通過(guò)

2.2.1 光譜校正步驟

2.2.1.1 按所用STR 試劑盒的說(shuō)明書，準(zhǔn)備光譜校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)品試劑，并創(chuàng)建光譜校準(zhǔn)操作流程(Spectral Protocol)和運(yùn)行模式(Spectral Run Module)。

2.2.1.2 按STR 試劑盒說(shuō)明書，創(chuàng)建光譜校準(zhǔn)板并運(yùn)行。

2.2.1.3 評(píng)價(jià)選定毛細(xì)管的光譜圖譜和原始數(shù)據(jù)。

2.2.1.4 對(duì)符合要求的光譜校準(zhǔn)文件進(jìn)行重命名并保存。

2.2.2 光譜校正的評(píng)價(jià)參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2.1 Q 值：Q 值表示得到的matrix 與理論值間一致性的參數(shù)。Q 值為1.0 表示實(shí)際matrix 與理論值完全相符，無(wú)任何pulldown 或pull－up 峰。minQ 表示對(duì)pull-up 或pull-down 峰的容忍度。默認(rèn)值為0.95。進(jìn)行光譜校正后，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算得到每根毛細(xì)管的Q 值，Q 值小于minQ(0.95)時(shí)，校正失敗。

2.2.2.2 C 值：表示染料組合中各染料發(fā)射光譜的染料峰的重疊程度。若染料峰間無(wú)重疊，則C 值為1.0,為最低可能值。隨重疊程度增加，C 值相應(yīng)增大。

2.2.2.3 確認(rèn)光譜中峰的順序從左至右為橙- 紅- 黃- 綠-藍(lán)。

2.2.2.4 查看光譜圖譜中，反應(yīng)板圖形中通過(guò)的毛細(xì)管數(shù)量(不通過(guò)，即黃褐色的反應(yīng)孔≤3 個(gè))。確認(rèn)光譜中的峰不含大范圍交迭、傾斜或其它不規(guī)則現(xiàn)象。

3 結(jié)論

測(cè)序儀在完成初始的空間校準(zhǔn)和光譜校正后，便可以收集數(shù)據(jù)并計(jì)算生成DNA 圖譜。伴隨時(shí)間遷移，光譜校正的效果也會(huì)發(fā)生變化，因此需要定期對(duì)測(cè)序儀進(jìn)行光譜校正。法醫(yī)物證鑒定應(yīng)用越來(lái)越廣泛，作為法醫(yī)物證鑒定人員，應(yīng)該深入了解測(cè)序儀工作原理，這樣才能有針對(duì)性的解決實(shí)際工作中遇到的各種問(wèn)題。光譜校正作為測(cè)序儀穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一，作為鑒定人員應(yīng)該熟悉常出現(xiàn)的問(wèn)題，以及掌握光譜校正的操作，確保能夠穩(wěn)定的收集到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。