稻米淀粉合成和食味品質改良研究進展

劉巖 傲雁 徐茂森 張濤 唐家琪 李堯卿 張超 于恒秀

摘要：稻米品質主要由碾磨品質、外觀品質、蒸煮與食味品質和營養品質等組成。隨著生活條件的逐步提升，人們對蒸煮與食味品質優良的稻米需求越來越高。而淀粉是稻米胚乳的主要成分，是影響其食味品質的重要因素，育種家們基于對淀粉合成相關基因與稻米蒸煮食味品質間的關聯分析結果，利用常規育種和CRISPR/Cas9等技術創建了一系列具有優良食味品質的水稻新品種（系）。本文總結了稻米品質的組成和影響因素、高等植物淀粉的生物合成途徑、淀粉合成底物ADPG的轉運途徑、直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成途徑、淀粉合成基因與稻米蒸煮食味品質改良的關系以及Wx基因等位變異在稻米品質改良中應用的研究進展，為以后稻米蒸煮食味品質改良提供參考。

關鍵詞：水稻;食味品質;直鏈淀粉;支鏈淀粉;生物合成;品種改良

中圖分類號：S511.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0018-08

水稻是世界上超過50%人口的食糧，也是我國重要的糧食作物，水稻生產在國民經濟中的地位十分重要[1]。在新時代，糧食安全的問題不容樂觀，育種工作的嚴峻性依然不容輕視，我們要走一條中國特色糧食安全之路。長期以來，我國水稻的生產和研究注重產量，對水稻的品質研究有所忽視，因此，生產的稻米品質并不能完全滿足國民的需求，且在國際市場上競爭力并不強。所以，培育優良食味品質的水稻品種便成了我國水稻育種工作重要的一部分，以達到滿足市場需求的目的。目前，利用基因編輯技術調控水稻胚乳淀粉合成的相關基因表達，是改良稻米食味品質行之有效的方法。

1 稻米品質的組成及影響因素

1.1 稻米品質的組成

在不同的地域，人們對稻米品質的偏好和要求各有差異，因此評價稻米品質的指標也有不同。在“中國好糧油-稻谷”LS/T3108—2017國家標準對優質大米的指標做了量化，由碾磨品質、外觀品質、蒸煮與食味品質和營養品質等共同組成稻米品質。而稻米的蒸煮食味品質有著密切的關系是稻米直鏈淀粉和支鏈淀粉的組成比。

1.2 稻米品質的影響因素

稻米研磨品質很受稻米加工企業的關注。稻谷在加工過程中會有多個步驟，最終以糙米率、精米率、整精米率3個數值來表示研磨品質。但是，這些指標也受到成熟期的田間溫度、濕度、收割等操作以及貯藏條件的影響。

外觀品質主要表現直接影響了籽粒的透明度，肉眼觀察以透明、半透明、不透明3種情況呈現，堊白多的水稻品種，碾米時容易碎米，出米率也低，因此，根據堊白對稻米外觀的影響，常用堊白粒率和堊白大小2個指標表示。目前，國際市場上，長粒型米因其堊白粒率較低而較為受歡迎。

蒸煮食味品質是稻米品質的核心。通過品嘗的方式決定往往有不易定量化和受主觀影響判斷較大，現多用測定稻米理化特性來表示：包括直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度、快速黏滯性譜等[2]。稻米直鏈淀粉含量與米飯的黏性、硬度、吸水性等均有緊密的相關性。直鏈淀粉含量低時，蒸煮時干燥而蓬松，色暗，冷卻后回生變硬。糊化溫度是指淀粉粒在受熱吸收水分開始膨脹時的溫度，這種變化是不可逆性。常用差示掃描量熱儀直接測糊化溫度，在稻米淀粉糊化溫度中，有以下3種：高（>74 ℃）、中（70～74 ℃）和低（<70 ℃）。煮飯所需時間與糊化溫度呈正相關。所以，稻米一旦蒸煮時間過長會對食味品質和外觀造成影響，所以認為中等糊化溫度的稻米食味品質最合適[3]。膠稠度是稻米淀粉膠體特性，是衡量米飯軟硬的評判標準，認為膠稠度的增加會使米質變軟[4]。RVA是稻米米粉勻漿在加熱、持續高溫和冷卻過程中黏度變化的動態圖。用最高黏度、熱漿黏度、冷膠黏度、崩解值、消減值、回復值、峰值時間和糊化溫度[5]。所以通過RVA譜比較可以很好地反映稻米品質。

營養品質主要是指稻米中的蛋白質和可吸收氨基酸含量。通常稻米中蛋白質含量越高，表示營養價值越高，但蛋白質可以和除淀粉之外的多聚糖結合形成堅固的結構，使稻米的彈性變差，變硬，稻米的蒸煮食味品質會降低。蛋白質含量除受大米本身的遺傳因子影響外，受環境因素和栽培技術影響也很大[6]。高溫是對稻米品質影響的最大因素，也是從事水稻研究、生產人員密切關注的科研方向[7]。并且水稻孕穗、開花和灌漿期處于一年中溫度最高的時間區，該時期反常的極端天氣將會對水稻各組分合成和積累造成重要的影響，間接降低稻米的品質和產量[8]。相關研究表明，高溫可以導致胚乳中光合產物積累不足，在籽粒灌漿期，高溫處理會導致直鏈淀粉含量和膠稠度都降低，蛋白質含量增加，但是淀粉粒結構并未發生變化[9]，同時還會增加碎米和堊白而降低稻米蒸煮食味品質[10]。

2 植物淀粉的生物合成途徑及相關基因的研究進展2.1 高等植物中淀粉的生物合成途徑

高等植物中，淀粉的主要合成位置是葉綠體和造粉體，淀粉是谷物中主要儲藏物，被用作碳骨架的主要儲存物，用于生物代謝。在水稻中白晝在葉綠體中合成的淀粉用于夜晚細胞代謝的其他途徑（圖1）。葉綠體中合成的是臨時淀粉，造粉體中合成的是貯藏淀粉。蔗糖在細胞液中通過酶的水解作用形成果糖及UDP-葡萄糖，果糖被果糖激酶水解形成6-磷酸果糖，而后通過磷酸葡聚糖異構酶的作用或者葡萄糖磷酸異位酶的催化作用形成6-磷酸葡萄糖或1-磷酸葡萄糖。UDP-葡萄糖可以形成1-磷酸葡萄糖，在AGPase酶的作用下形成腺苷二磷酸葡萄糖，最終再經過一系列淀粉合成相關酶的作用下合成淀粉[11]，從而為種子生長和發育供應所需要的能量和營養，在種子萌發和幼苗早期生長發育起著至關重要的作用[12-13]。

淀粉合成的網絡是由多個基因參與的復雜網絡過程。淀粉的合成是在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合（成）酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶四類關鍵性酶協同下，才能完成淀粉的生物合成[13]。

2.2 淀粉合成底物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的轉運途徑

淀粉合成過程中的第一個關鍵酶是腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，它具有催化1-磷酸葡萄糖和磷酸腺苷反應生成腺苷二磷酸葡萄糖，并且釋放焦磷酸的功能。因此，淀粉合成的限速酶是ADP-葡萄糖焦磷酸化酶[14]。在高等植物中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是由2個大亞基和2個小亞基組成的異源四聚體[13]。水稻中鑒定到6個ADP-葡萄糖焦磷酸化酶家族的成員，分別編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的2個小亞基和4個大亞基，命名為AGPS1、AGPS2和AGPL1、AGPL2、AGPL3、AGPL4[15]。其中AGPS2（8號染色體）存在AGPS2a和AGPS2b這2種剪接形式。并且這2種ADP-葡萄糖焦磷酸化酶蛋白存在很高的功能和結構相似性[16-17]。AGPL1和AGPS1在葉綠體中互作形成全酶，催化淀粉生物合成。在幼苗地上部，AGPL1和AGPS1均在葉片、葉鞘和基節等全部器官中表達。在初生根和冠根中，2種基因的表達都局限于根尖的伸長和成熟區以及靠近根尖的區域[18]。AGPL1在水稻種子發育中期優勢表達，其表達和培養細胞中淀粉含量受蔗糖和脫落酸濃度的協同調控[15]。穎果發育過程中，AGPL2在水稻籽粒灌漿和淀粉合成中發揮重要的調控作用[19]。AGPL2和AGPS2b相互作用，對水稻胚乳貯藏物質如淀粉和蛋白的積累十分重要。在缺少AGPL2時，AGPS2b可能不能自身互作形成高分子量聚合體。因此，水稻AGPase組裝的分子機制可能與擬南芥存在差異[20]。AGPL4影響淀粉合成，進而影響花粉育性，因此，AGPL4突變會阻礙淀粉合成，而導致花粉不育[21]。

2.3 直鏈淀粉的合成

稻米胚乳直鏈淀粉是蠟質基因（Wx）編碼的蛋白質顆粒結合淀粉合酶Ⅰ催化的，Wx基因對稻米胚乳直鏈淀粉的含量產生最直接影響，對大米的烹煮和食用品質屬性具有重要的影響[22-23]。

稻米直鏈淀粉是α-D-葡萄糖通過α-1，4-糖苷鍵連接形成的數千個單位長的葡聚糖鏈狀分子，幾乎沒有分支或者分支極少[24]。直鏈淀粉的合成發生在淀粉和蔗糖代謝及糖酵解/糖異生過程中，與淀粉和蔗糖代謝直接相關[25-26]。主要由顆粒淀粉合成酶催化合成[26]，顆粒結合淀粉合酶是一種葡萄糖基轉移酶，專門負責延長直鏈淀粉聚合物，Wx基因是在不影響支鏈淀粉的情況下直接控制直鏈淀粉含量的唯一靶點。在水稻中，顆粒結合淀粉合成酶分別為GBSSⅠ和GBSSⅡ，GBSSⅡ主要在葉片中表達，參與葉綠體中臨時淀粉的合成，GBSSⅠ主要在胚乳中表達，與胚乳中淀粉的生物合成有關聯。

相關研究表明，擬南芥中直鏈淀粉合成也需要靶向淀粉的蛋白（PTST）。PTST是一種具有N-末端卷曲結構域和C-末端糖結合模塊（CBM）的可塑性蛋白。顆粒結合淀粉合酶通過卷曲結構域與PTST發生物理作用。此外，還發現PTST的CBM結構域介導了其與淀粉顆粒的相互作用，這也是正確的顆粒結合淀粉合酶定位所必需的。熒光標記的擬南芥顆粒結合淀粉合酶在煙草或擬南芥葉片中表達，都需要擬南芥PTST的存在來定位淀粉顆粒。PTST的CBM突變導致顆粒結合淀粉合酶留在質體基質中。而擬南芥中已經發現PTST的3個同源基因：PTST1、 PTST2和PTST3。PTST實現了一種以前未知的功能，即靶向顆粒結合淀粉合酶淀粉，揭示了靶向生物合成酶的重要性。重要的是PTST代表了一個有希望的新的基因靶點，使生物技術修飾淀粉成分成為可能，目前只有PTST1參與直鏈淀粉的合成[27]。研究發現擬南芥ptst1突變體無法合成直鏈淀粉，顆粒結合淀粉合酶蛋白顯著減少，并且在表型上與缺乏顆粒結合淀粉合酶的突變體相似。因此，目前新鑒定出了水稻顆粒結合淀粉合酶結合蛋白OsGBP，很大可能就是PTST1同源基因，而osgbp突變體與野生型相比，突變體葉片和籽粒中直鏈淀粉含量會降低[28]。

2.4 支鏈淀粉的合成

稻米支鏈淀粉是由α-D-葡萄糖通過α-1，4-糖苷鍵和α-1，6-糖苷鍵共同連接形成的高度分支的葡萄糖聚合物[29]。支鏈淀粉的生物合成也是受多種酶的協同完成的，每一種酶都扮演著不同的角色。其中SS會通過影響支鏈淀粉的延伸達到對支鏈淀粉合成的調控（圖2）[30]。并且存在8種同工型，分別為SSⅠ、SSⅡ-1（SSⅡc）、SSⅡ-2（SSⅡb）、SSⅡ-3（SSⅡa）、SSⅢ-1（SSⅢb）、SSⅢ-2（SSⅢa）、SSⅣ-1（SSⅣa）和SSSⅣ-2（SSⅣb）[31]。SSⅠ和SSⅡa分別主要負責合成支鏈淀粉短鏈和支鏈淀粉短支鏈（DP≤12），對直鏈淀粉含量的影響較小[1，32]。SSⅡa/SSⅢa的雙突變體與野生型相比，結果會導致籽粒出現堊白、直鏈淀粉含量增加、糊化溫度升高、黏度降低的現象[33-35]。水稻胚乳產生特有的復合顆粒，在一個淀粉體中含有幾十個多面體淀粉顆粒，其他一些谷物品種產生簡單型顆粒，即每個淀粉體只有1個淀粉顆粒[36]。SSⅢa和SSⅣb突變會導致水稻胚乳淀粉顆粒形態由多面體變為球形[37]。過表達SSⅣ會導致擬南芥葉片淀粉積累水平增加30%～40%，株系表現出較高的生長率[38]。在長期貯藏的淀粉器官如馬鈴薯塊莖中，觀察到SSⅣ表達增強導致淀粉含量的增加。表明SSⅣ是控制淀粉在質體中積累量的調控步驟之一[39]。

在水稻中淀粉分支酶存在3種同工型：SBE1（SBEⅠ）、SBE3（SBEⅡb）、SBE4（SBEⅡa）[40]。SBE1編碼1個糖苷水解酶13家族蛋白[41]。SBE1的突變會導致幼苗白化、葉綠體發育異常，在三葉期死亡[42]。作用是催化葡萄糖鏈產生由α-1，6糖苷健連接的分支酶。純化酶體外試驗表明，SBEⅡb形成了DP7和DP6的外部短鏈[43]。SBE3突變會導致支鏈淀粉鏈長減少，同時會導致直鏈淀粉和抗性淀粉含量明顯上調[44-45]。從SBE同工酶的氨基酸序列同源性方面看，SBE4更類似于SBE3[46]。

淀粉去分支酶分為2類：間接去分支酶和直接去分支酶。間接去分支酶存在于動物、酵母中[47]。直接去分支酶起水解α-1，6-糖苷鍵的作用，包括異淀粉酶ISA1、ISA2、ISA3和普魯蘭酶[13]。ISA編碼基因突變后會使支鏈淀粉的積累無法達到正常情況。相關研究表明，ISA1的突變會導致籽粒淀粉含量減少，可溶性葡聚糖和糖原大量積累，呈現為糖質胚乳，并且容易穗發芽[48-49]。水稻中過表達ISA2會導致所有的ISA1形成異源寡聚體，使淀粉的合成受到影響[50]。

3 淀粉合成基因與稻米蒸煮食味品質的關系

通過淀粉的生物學合成途徑以及淀粉的組成精細結構研究表明，淀粉合成相關基因都直接或間接性地對稻米的蒸煮食味品質產生影響（圖3）[51]。到目前為止，只有Wx基因是即對稻米直鏈淀粉含量，又可以對膠稠度的產生影響的主效基因[52-53]。除此之外，在SS Ⅱ基因中，SS Ⅱ-3是作為唯一控制糊化溫度的主效基因，在胚乳中最高的表達量，是通過酶活降低或缺失導致支鏈淀粉A鏈增加，B1鏈減少的方式，酶活降低的主要原因是關鍵氨基酸的變異。且SS Ⅱ-3基因和Wx基因位于水稻6號染色體上相鄰位置。目前已經有同時對SS Ⅱ-3基因和Wx基因進行編輯從而達到改良稻米蒸煮食味品質研究。為此，國內各機構和高校紛紛展開對稻米蒸煮食味品質改良的研究，四川農業大學按Wx基因型分類，通過多代回交，對21個純合GC型供試品種和39個TT型供試品種進行糊化溫度分析，分析結果表明，稻米糊化溫度與直鏈淀粉之間不存在著顯著的相關性;直鏈淀粉含量有差異的水稻品種，糊化溫度也高低不一;因此，推斷控制糊化溫度的基因位點和Wx基因位點無關系。而稻米的直鏈淀粉含量和膠稠度則存在著不同程度的負相關關系，是由Wx基因控制的。同時，亦說明稻米的膠稠度也是由Wx基因或與其連鎖的基因控制的[54]。同樣，西南科技大學證明了Wx基因與SS Ⅲ-2基因互作，且Wx基因對SS Ⅲ-2基因有顯性上位性[55]。李錢峰等把日本晴背景的SS Ⅱ-2 RNAi轉基因材料與直鏈淀粉含量相近的軟米對照在不同含水量情況下的籽粒外觀進行比較，SSⅡ-2 RNAi轉基因稻米在低含水量下仍保持良好的透明度，未出現類似于軟米暗胚乳（半透明）缺陷，而抑制SS Ⅱ-2 基因的表達在非糯背景中可協同調控直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成進而改良稻米蒸煮食味品質[56]。對抗條紋葉枯病武運粳8號的SS Ⅱ-2基因的RNA干擾轉基因植株研究成果也類似，直鏈淀粉含量降低的情況下，糊化溫度會上升，蒸煮的米飯光澤、外觀、口感、黏度均有所提升，對稻米蒸煮食味品質改良達到顯著效果[57]。研究水稻淀粉合成相關基因與稻米直鏈淀粉含量、膠稠度和糊化溫度之間的遺傳關系，不僅對膠稠度和糊化溫度的遺傳機制及相關基因的定位克隆有幫助，而且對稻米蒸煮食味品質的改良效果更明顯。這對于常規栽培水稻品種的品質研究也有指導作用，同時為稻米品質改良的遺傳研究提供了理論基礎。

近期四川農業大學任萬軍教授團隊根據稻米食味值的已有研究基礎，通過對西南地區36個常規秈稻品種食味值研究，劃分為3個食味類型：（高食味類型食味值=72.76;中食味類型食味值=68.2;低食味類型食味值=61.7）。高食味類型的含義是直鏈淀粉和蛋白質含量都比較低，峰值黏度和崩解值比較高，熱漿黏度、回復值和最終黏度低，為評價秈稻米的食味品質提供了理論基礎[58]，也為不同背景的秈稻米食味品質材料積累了基礎研究數據。

4 Wx基因等位變異在稻米品質改良中的應用

水稻Wx基因的自然等位變異是導致不同水稻品種淀粉含量不同的主要因素。非糯性基因（Wx）對糯性基因（wx）表現為不完全顯性，存在著較為顯著的劑量效應[59]。在自然界中，Wx基因主要有2種常見的類型，一是Wxa，常見于直鏈淀粉含量較高的秈稻（25%）;二是Wxb，常見于直鏈淀粉含量較低的粳稻（AC-16%）[26]。由于直鏈淀粉的含量屬于轉錄后的調控，與內含子的表達能力有著重要的關系[52]，因此，目前研究方向是通過對Wx基因轉錄水平的表達調控來達到影響淀粉含量的目的，以期達到改良稻米蒸煮食味品質[60-61]。此外，研究人員通過序列分析研究表明，相較于Wxa而言，Wxb的第1內含子5′端剪切時的突變（G→T），會導致第1內含子剪接出錯，結果會以直鏈淀粉含量下降的形式呈現[62]。而糯性基因wx屬于Wx基因的突變，造成的功能性缺失[63]。正是因為Wx基因的自然等位變異導致水稻品種直鏈淀粉含量和蒸煮食味品質存在廣泛差異[64]，發現Wx基因的表達受到抑制或者增強時候，對轉基因水稻主要農藝性狀的影響最小。

基于以上研究基礎，近年來，育種家們通過CRISPR/Cas9技術對Wx基因進行編輯，調節淀粉相關基因的表達，以期達到改良稻米蒸煮食味品質。浙江大學作物科學研究所對水稻品種哈勃601 Wx基因進行定向突變，進而培育出精米與親本相似純合突變系，精米為橢圓形，但米粒呈蠟質狀，不透明，與哈勃601米粒透亮外觀形成顯著對比[65]。因此，通過CRISPR/Cas9技術將淀粉合成相關基因進行編輯快速獲得不同基因型的純合突變體是改良稻米蒸煮食味品質的一個重要途徑[66]。

基于Wx基因復等位基因的同源重組和淀粉合成相關基因的重組創建新型水稻種質資源（Wxmw/Wxla），而達到直鏈淀粉含量降低改良稻米蒸煮食味品質的目的。除此之外，Wxop、Wxmp、Wxmq等復等位基因控制介于粳稻和糯稻之間的低直鏈淀粉含量品種;Wxin等位基因控制介于秈稻和粳稻之間的中等直鏈淀粉含量品種[23，63，67-68]。研究表明，攜帶Wxmp基因的水稻品種中，直鏈淀粉含量約為10%（南粳46為10.6%），且主要分布于江滬一帶[69]。而該品種是市場上較為流行的“軟米”，具有米飯柔軟、富有彈性、冷卻后不易變硬等優點，因此Wxop、Wxmp、Wxmq等復等位基因也被成為“軟米基因”[70-71]。由于直鏈淀粉含量受環境條件的影響比較大，如高溫、高濕度等氣候因素，且江蘇地理上南北走向較大，因此培育適合各地的優良食味品質的稻米品種成為科學家的目標。目前，江蘇地區推廣較廣的是南粳5055、南粳46和南粳9108，這些品種可以適合江蘇省各不同地區種植，即江蘇省不同地區均有了適合種植的優質軟米。

在作物育種中，將遺傳變異引入到優異推廣品種中，是快速推進育種進程的重要手段。伴隨著CRISPR/Cas9 系統的基因編輯技術的快速發展，為作物基因組單堿基編輯方法的建立起到了重要作用。中國科學院遺傳與發育生物學研究所在前期工作基礎上，在小麥、水稻和玉米基因組中實現高效、精確的單堿基定點突變。基于作物基因組單堿基編輯方法的成熟，揚州大學農學院劉巧泉教授課題組利用CRISPR/Cas9編輯技術對Wx基因進行編輯，在Wxb背景下創建了6種直鏈淀粉含量微調的新型Wx等位基因，新型Wx等位變異的直鏈淀粉含量介于粳稻和軟米之間，且互相之間存在差異，但籽粒外觀仍然保持高度透明，且在不同的溫度條件下稻米蒸煮食味品質均有所改良[72]。

同時，伴隨著基因組編輯效率和精度的提高，遺傳變異和高效的篩選體系將不再是困擾作物育種的重要因素。分子模塊設計育種的發展也逐步開始進入研究。

5 結論與展望

隨著基因工程技術的快速發展，對稻米食味品質的快速改良已經成為了可能。特別是通過對稻米淀粉合成相關基因的功能分析，已經日趨完善對淀粉合成的遺傳調控機制理解[73-74]，將會給常規育種工作中的難題帶來解決方案。從國家糧食安全角度出發，要加強稻麥等主要糧食作物的遺傳育種研究，如加強種質資源的保護，推進種子庫的建立，以及將常規育種技術與生物技術結合以推進育種目標符合市場的需求。目前市場上備受追捧的主要是東北大米、江蘇大米和泰國大米等優良食味品種，我國是一個幅員遼闊、氣候環境多樣的大國，擁有著豐富的種質資源待開發和利用。不過隨著生物技術的發展，特別是近年來CRISPR/Cas9技術在水稻育種中成熟應用及與傳統育種技術的結合，將會有利于基因發掘，也將快速地應用到育種實踐中。可喜的是我國水稻和小麥2個最基本口糧已完全自主選育品種，并且產量較高，基本滿足人們的需要，但是，不同人群以及不同的加工產品對稻米品質的要求越來越高，對水稻育種工作的要求也越來越高。隨著對淀粉合成相關基因研究的不斷深入，圍繞Wx基因和SS基因表達調控改良稻米品質的研究取得了長足進展。縱觀過去多年全國各地作物研究所在水稻育種中取得的成績，已經在稻米食味品質改良中有了一定的基礎，通過降低稻米直鏈淀粉含量，來提高稻米蒸煮食味品質已經有了突出成果，達到全民由“吃得飽”到“吃得好”的跨越，這也是育種工作者的目標。相信通過常規育種與現代分子生物學技術結合也將會培育出更多的適合于中國廣袤的土地生長的優質水稻新品種（系）。

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