豬源丁酸梭菌DSY-1產芽孢高密度發酵條件優化

杜全能 區毅恒 余杰豪 劉子恒 史寶軍

摘要：為獲取丁酸梭菌芽孢高密度發酵工藝，以丁酸梭菌DSY-1為試驗材料，以芽孢數為指標，通過單因素試驗，探究碳源、氮源、接種量、初始pH值、培養溫度和正交試驗，并通過5 L發酵罐進行中和劑選擇。結果表明，菌株DSY-1以C6H12O6 30 g/L、酵母提取粉10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸鈉 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸鹽 0.5 g/L為發酵培養基，初始pH值為6.5，培養溫度為35 ℃，接種量為2.5%，5 L發酵灌發酵使用12.5%氨水作中和劑時，菌株 DSY-1 芽孢數最大，達9.3億CFU/mL。

關鍵詞：丁酸梭菌;正交試驗;芽孢生物量;發酵工藝

中圖分類號：S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0148-05

隨著我國養殖業的發展，養殖模式已經轉向集約化、規模化發展。為了減少病害，人們在飼料中添加抗生素，雖起到了促進動物生長的作用，但也造成了抗生素的濫用。我國每年約8 000 t的抗生素被用于動物疾病預防和治療[1]。在禁抗大背景下，禁抗替抗已成為養殖行業持續健康發展和食品安全的重點話題。近年來，益生菌作為替抗產品，乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等已被廣泛應用于養殖業中[2-3]。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）屬于梭菌科梭菌屬，為革蘭氏陽性厭氧桿菌，具有耐胃酸、耐膽鹽特性。自1933年，日本Miyairy博士首次從糞便中分離出丁酸梭菌便引起了科學家廣泛關注。目前，丁酸梭菌被廣泛應用于養殖行業中。研究發現，在基礎日糧中添加丁酸梭菌能夠增強機體的免疫力、提高抗氧化性能[3-4]、改善肉品質[5-6]和腸道組織形態[7-11]、抑制腸道中有害菌群、提高有益菌群豐度[11-12]。

目前，制約丁酸梭菌微生態制劑大規模生產的主要因素是制備過程中菌體量和芽孢量過低。本試驗采用單因素試驗和正交試驗優化發酵培養基和5 L發酵罐培養優化，探究對丁酸梭菌芽孢產量的影響，為丁酸梭菌芽孢的高密度發酵提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 丁酸梭菌DSY-1由筆者所在實驗室篩選獲得。

1.1.2 培養基 種子液：蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化鈉 5 g/L、可溶性淀粉 1 g/L、乙酸鈉3 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。pH值7.0±0.1，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、NaCl 10 g/L。固體培養基加20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

活化培養基：同種子液，加20 g/L瓊脂。pH值 7.0±0.1，121 ℃滅菌20 min。

芽孢計數培養基：下層為TSC培養基+5 g/L瓊脂，上層：18 g/L海藻酸鈉+30 g/L TSC培養基。121 ℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基：C6H12O6 30 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸鈉 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸鹽 0.5 g/L，pH值6.4±0.1，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗藥品 蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、可溶性淀粉、瓊脂（BR），廣東環凱生物科技有限公司生產;K2HPO4、MgSO4·7H2O、C6H12O6、NaCl、乙酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、海藻酸鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司生產;TSC培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司生產。

1.1.4 試驗儀器 雷磁pH計（pH-3C），上海儀電科學儀器股份有限公司生產;厭氧袋（C-11），日本三菱公司生產;鼓風干燥箱（DHG-9246A），上海精宏實驗設備有限公司生產;恒溫培養箱（DNP-9052），上海精宏實驗設備有限公司生產;高壓滅菌鍋（YXQ-LS-100S），上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產;顯微鏡（CX-23），日本奧林巴斯;電子天平（ME204E），梅特勒-托利多儀器有限公司生產;超凈工作臺（SW-CJ-ID），蘇州凈化設備有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及種子液制備 吸取于-80 ℃甘油管保藏的菌種DSY-1 1 mL，接種于液體種子液中，并置于厭氧培養箱中37 ℃培養24 h。

1.2.2 發酵培養 將培養24 h的種子液按3 ∶ 100（體積比）接種于裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃厭氧培養箱中培養48 h。

1.2.3 芽孢計數 芽孢計數方法與李雯靜等的方法[13]相同。

1.2.4 不同因素對菌株DS-1芽孢產量的影響 為了探究菌株DSY-1最佳碳源，選取淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖來替換基礎發酵培養基中的葡萄糖，添加量均為1%;在最佳氮源選擇試驗中，選取牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨來替換基礎發酵培養基中的氮源，添加量均為3%;為了研究接種量對菌株 DSY-1 芽孢產量的影響，分別以體積分數為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的接種量將種子液接入發酵培養基中;為了探究初始pH值對菌株芽孢產量的影響，利用3 mol/L HCl或3 mol/L NaOH調節培養基中的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5;上述試驗接種量均為2.5%，置于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。在上述試驗的基礎上，探究不同培養溫度對菌株DSY-1生長的影響，將發酵培養基置于25、30、35、40、45 ℃恒溫培養箱中培養。以上所有試驗均進行3次重復。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗結果的基礎上，采用正交試驗優化菌株DSY-1產芽孢最佳條件。本試驗選取初始pH值（A）、培養溫度（B）、接種量（C）3個對菌株產芽孢影響較大的因素，對其進行3因素3水平試驗，以確定上述3因素對菌株DSY-1產芽孢最佳組合，其正交試驗設計見表1。

1.2.6 5 L發酵罐發酵試驗 在“1.2.5”節試驗結果的基礎上配制培養基，裝液量70%，接種量3%，轉速50 r/min，培養溫度為35 ℃，培養時間為48 h。發酵過程不控制pH值自然發酵;發酵過程中前 24 h，用12.5%氨水將pH值維持在6.5±0.2。

1.2.7 不同中和劑對菌株DSY-1芽孢產量的影響 在上述單因素試驗和正交試驗結果的基礎上，以12.5%、25.0%、50.0%氨水，3 mol/L NaOH、3 mol/L Ca（OH）2、3 mol/L KOH調節pH值。

1.2.8 數據分析 使用Excel統計數據，采用統計軟件SPSS 25中的One-Way ANOVA進行單因素方差分析，用Turkey多重比較法對處理間的差異性進行比較分析，結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0.1作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株DSY-1菌落形態與菌體形態

菌株DSY-1在計數平板上的菌落形態見圖1，菌落表面光滑、不透明，呈黑色。菌體形態見圖2，為革蘭氏陽性菌，有芽孢產生，菌體成桿狀。

2.2 不同碳源對菌株DSY-1產芽孢的影響

碳源作為細胞合成的骨架和能量來源，在細胞生長過程中起著重要的作用。從圖3中可以看出，麥芽糖和乳糖對菌株產芽孢不存在顯著性差異（P>0.05），其余碳源對菌株DSY-1產芽孢存在顯著性差異（P<0.05）。其中，淀粉、乳糖、蔗糖和麥芽糖4種碳源屬于多糖和雙糖，菌株 DSY-1 對其利用均低于葡萄糖。在以葡萄糖為唯一碳源時，菌株 DSY-1 芽孢產量最大，可達（2.40±0.10）億CFU/mL，因此采用葡萄糖作為唯一碳源進行后續試驗。

2.3 不同氮源對菌株DSY-1芽孢產量的影響

氮是構成微生物細胞的蛋白質及核酸的主要物質。從圖4可以看出，5種氮源對菌株DSY-1芽孢產量存在顯著影響（P<0.05）。5種氮源中芽孢產量從大到小表現為酵母提取粉>蛋白胨>牛肉膏>尿素>硫酸銨，可能是由于丁酸梭菌生長需要的營養比較復雜，而無機氮無法提供。酵母提取粉為唯一氮源時，菌株芽孢數最大，達（3.47±0.25）億CFU/mL。

2.4 接種量對菌株DSY-1芽孢產量的影響

接種量可以影響菌體增殖的速度，適當的接種量能夠縮短菌體的延滯期。從圖5可以看出，隨著接種量的增加，菌株DSY-1芽孢產量呈先上升后下降的趨勢，在接種量為3%時，芽孢產量達到最大。接種量低，引起菌株延滯期過長;而當接種量超過3%時，或許由于菌體生長過快，培養基中pH值下降，造成酸脅迫效應;在接種量為3%時，菌株DSY-1獲得的芽孢最多，為（4.47±0.04）億CFU/mL。

2.5 不同初始pH值對菌株DSY-1芽孢產量的影響

由圖6可知，在初始pH值5.5～7.5之間，菌株芽孢產量存在顯著差異（P<0.05）;而在初始pH值6.0～6.5之間，菌株DSY-1芽孢產量不存在顯著差異（P>0.05）。可見，菌株DSY-1適合在弱酸性條件下生長，且菌株DSY-1在初始pH值6.5時具有最大芽孢產量，為（4.47±0.18）億CFU/mL。

2.6 不同培養溫度對菌株DSY-1芽孢產量的影響

培養溫度對菌株DSY-1芽孢產量存在顯著性影響（P<0.05），從圖7可以看出，隨著培養溫度升高 菌株芽孢產量呈先上升后下降的趨勢。培養溫度過低或過高可能影響菌株DSY-1代謝活動，進而影響菌體的生長;在溫度為35 ℃時，菌株芽孢產量達到最大，為（5.82±0.10）億CFU/mL。

2.7 正交試驗結果

從表2可以看出，以芽孢產量為指標，通過正交試驗發現，影響菌株DSY-1芽孢產量因素表現為培養溫度>初始pH值>接種量，最優組合為A2B2C3，即發酵培養基初始pH值為6.5，培養溫度為35 ℃，接種量為2.5%時，菌株DSY-1具有最大芽孢產量。

2.8 自然發酵與控pH值發酵

從表3可以看出，用50%氨水控制pH值6.5發酵芽孢數是自然發酵的1.7倍，可見酸脅迫嚴重抑制菌株DSY-1的生長，而通過控制發酵pH值可大幅度提高芽孢產量。

2.9 不同中和劑對菌株DSY-1芽孢產量的影響

從圖8可以看出，不同中和劑對菌株DSY-1產芽孢存在顯著性影響（P<0 .05）。以12.5%氨水為中和劑時，菌株DSY-1具有最大的芽孢產量。而當氨水為25%和50%時，芽孢產量均低于12.5%氨水，可能是由于氨濃度過高不能及時中和，導致發酵液中游離氨濃度升高，進而抑制菌體生長。當以NaOH和Ca（OH）2、KOH作為中和劑時，效果均低于氨水。可能是由于鹽離子影響細胞內外滲透壓，不利于菌體的生長。因此，選用12.5%氨水作為中和劑進行控pH值。

3 討論與結論

本次碳源試驗結果發現，以葡萄糖作為唯一碳源時，菌株DSY-1具有最佳芽孢產量，這與徐瑩等研究結果[14-16]一致。也有研究者發現，可溶性淀粉[17]、麥芽糖[18]作為唯一碳源時，丁酸梭菌具有最大的芽孢產量。李雯靜等認為，面粉和米粉作為混合碳源時，可獲得最大的芽孢產量。可見，不同菌株對于碳源的利用情況有所差異[13]。

菌株DSY-1在以酵母提取粉為唯一氮源時，具有最大的芽孢產量，這與邢宏觀等的研究結果[17]一致。而徐瑩等認為，以胰蛋白胨為唯一氮源時具有最大的芽孢產量[14]。而菌株HDRyYB1[13]以魚粉、酵母粉作為混合氮源時，具有最大的芽孢產量。史禎暉研究發現，菌株SHYY088以酵母自溶粉和酵母浸膏作為混合氮源時，具有最大的芽孢產量[18]。接種量過高或過低均影響菌株的生長，接種量過大使得代謝產物積累過快，造成酸脅迫;而過小則引起延滯期過長，本試驗結果與胡曉龍等結論[19]相似。

初始pH值和培養溫度是制約丁酸梭菌高密度生長的重要因素，過低或過高的初始pH值會改變細胞膜的通透性，進而影響菌體的生長和代謝;而培養溫度則影響生物體重酶的活性，從而造成菌體代謝緩慢。有研究認為，初始pH值在7.2～7.4[13]、7.3[16]時，菌株具有最大的芽孢產量。趙旭冬研究發現，通過補堿使pH值維持在6.8，所得芽孢數高于自然發酵[15]。史禎暉認為，pH值6.5更適合菌株生長[18]。而Li等發現，在初始pH值 6.0～7.5對丁酸梭菌NN-2活菌數和產芽孢數均無顯著性影響（P>0.05）[20]。本試驗結果與趙旭冬研究結論[15]相一致，在pH值為6.8時能夠獲得最多芽孢。本試驗發現，菌株DSY-1在35 ℃下，產芽孢量達到最大。相關研究發現，丁酸梭菌在 32 ℃[18]、37 ℃[16]具有最大芽孢產量。

在發酵過程中調控pH值有利于緩解酸脅迫，利于菌體的生長。眾多研究發現，在發酵過程中通過調控pH值有利于菌體的生長[14-15，21]，這與本試驗結果相一致。

通過單因素試驗和正交試驗確定碳源、氮源、培養條件對丁酸梭菌DSY-1產芽孢的影響。在以葡萄糖和酵母提取粉分別作為唯一碳源和氮源，培養溫度為35 ℃、初始pH值為6.5，接種量為2.5%時，菌株DSY-1具有最大的芽孢產量。在5 L發酵試驗中，通過使用12.5%氨水在發酵前 24 h使pH值維持在6.5，使得芽孢數是自然發酵的1.7倍，最終芽孢產量為（9.30±0.09）億CFU/mL。

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