轉錄組分析產紫籃狀菌Q2菌株抑制尖鐮孢菌生長的潛在機制

趙洋，田葉韓，高克祥，付學松

（山東農業大學植物保護學院，山東 泰安 271018）

尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）包括致病型和非致病型，致病性尖鐮孢菌可為害香蕉、番茄、西瓜、大豆和棉花等100多種重要的經濟作物［1－3］，由尖鐮孢菌引起的作物枯萎病在全球范圍內造成的損失逐年增加［4］。尖鐮孢菌在自然界中可產生大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子。尖鐮孢菌主要以休眠的厚垣孢子在土壤中生存，即使在沒有宿主的情況下也可以在土壤中存活10～15年［5］。厚垣孢子可以通過土壤、水、農具和人類等媒介傳播，并成為下一年的主要傳染源［6］。

生物防治是一種生態無害的植物病害防治方法，被認為是控制土傳病害最有潛力的措施。目前，木霉菌（Trichoderma）、鏈霉菌（Streptomyces）、青霉菌（Penicillium）、非致病尖鐮孢菌（nonpathogenicF．oxysporum）、毛殼菌（Chaetomium）、芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）等有益微生物已經被應用于枯萎病的防治。鏈霉菌FJAT－31547菌株預先接種番茄后，番茄枯萎病的發病率降低80.59%，青枯病的發病率降低76.92%［7］。鏈霉菌CT205菌株對溫室黃瓜枯萎病的防效為51.85%［8］。鏈霉菌IC10菌株對番茄枯萎病的防效比化學殺菌劑提高12.5%［9］。青霉菌可明顯減輕尖鐮孢菌侵染對芝麻植株的危害［10］。非致病性尖鐮孢菌已被應用于防治番茄、黃瓜和西瓜等作物的枯萎病［11］。棘孢木霉（T．asperellum）PRR2與木霉菌NRCB3聯合使用可使香蕉枯萎病的發病率下降47%［12］。貝萊斯芽孢桿菌（B．velezensis）F21在溫室和田間對西瓜枯萎病的防治效果分別為80.35%和65.81%［13］。

產紫籃狀菌（Talaromyces purpureogenus）Q2菌株是本實驗室從苦瓜連作土壤中分離得到的一株對苦瓜枯萎病具有良好防治效果的生防真菌。籃狀菌屬原屬于青霉屬下亞屬，后來通過分子種系學研究發現籃狀菌與青霉差異較大，隨后將籃狀菌屬分出單獨研究［14］。前期的研究發現，菌株Q2對苦瓜枯萎病、煙草黑脛病、煙草根黑腐病和馬鈴薯莖基腐病等多種土傳病害具有良好的防治效果，對苦瓜枯萎病的防治效果達到50%以上［15］。宏基因組和微生物多樣性分析結果表明，菌株Q2可在土壤中穩定定殖，并直接抑制土壤中尖鐮孢菌種群的恢復趨勢。同時，菌株Q2可通過誘導植物木質素及其合成相關基因的表達，增強苦瓜植株對枯萎病的抗病性（未發表數據）。然而，我們對產紫籃狀菌抑制尖鐮孢菌生長的作用機理尚不清楚。本試驗通過產紫籃狀菌和尖鐮孢菌的共培養觀察尖鐮孢菌菌絲形態變化，并采用轉錄組技術分析在尖鐮孢菌誘導下產紫籃狀菌的基因表達差異，從轉錄水平揭示產紫籃狀菌抑制尖鐮孢菌生長的作用機制，旨在為產紫籃狀菌有效防控枯萎病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：產紫籃狀菌（Talaromyces purpureogenus）Q2菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC NO.13165；尖鐮孢菌苦瓜專化型（Fusarium oxysporumf.sp.momordicae）SG－15菌株，保藏于中國農業微生物菌種保藏管理中心，編號為ACCC 39204。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L）；馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB，去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1 L）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株Q2對菌株SG－15的生長抑制作用 將0.2 mL的SG－15菌株小型分生孢子懸浮液（1×108cfu／mL）分別與0（CK）、0.01（T1）、0.10（T2）、1.00（T3）、5.00（T4）、10.00（T5）mL的Q2分生孢子懸浮液（2×107cfu／mL）混合后補充無菌水至10.2 mL，接種于100 mL PDB中。28℃、180 r／min共培養3～5 d，使用3層擦鏡紙過濾，收集不同處理組的菌絲和孢子。在Nikon Eclipse 90i顯微鏡下觀察菌絲及其分生孢子形態，并進行測量和拍照；使用血球計數板對過濾液中菌株SG－15分生孢子計數。采用PI染色法檢測菌株SG－15分生孢子活性：取1 mL過濾液離心棄去上清液，收集菌株SG－15孢子于離心管底部，加入0.01 mol／L磷酸緩沖液（PBS）1 mL重懸，然后加入10μL碘化丙啶（PI）染液，室溫暗處理15 min，離心后將孢子用1 mL PBS洗滌兩次后再用PBS重懸，印片后于熒光顯微鏡下觀察，PI最大激發波長和最大發射波長分別為488 nm和630 nm，此時死亡的菌株SG－15孢子會發出紅色熒光。

1.2.2 菌株Q2產幾丁質酶和葡聚糖酶能力 將菌株Q2（接種量2×105cfu／mL）分別接種于100 mL的PDB基礎培養基（記為Q2）、含有菌株SG－15分生孢子（2×105cfu／mL）的PDB培養基（記為Q2－FOM），另設只含有菌株SG－15分生孢子（2×105cfu／mL）的PDB培養基（記為FOM）。28℃、180 r／min培養7 d，過濾菌絲，采用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定發酵液中幾丁質酶和葡聚糖酶活性。

1.2.3 轉錄組分析菌株Q2抑制菌株SG－15生長機理 試驗設置兩個處理，每個處理3次重復。菌株Q2純培養（Control）：將1.0 mL菌株Q2分生孢子懸浮液（2×107cfu／mL）接種于100 mL PDB培養基中；菌株Q2與菌株SG－15共培養（FOM）：0.2 mL菌株SG－15分生孢子懸浮液（1×108cfu／mL）與1.0 mL菌株Q2分生孢子懸浮液（2×107cfu／mL）接種于100 mL PDB中。28℃、180 r／min培養3 d，使用3層擦鏡紙過濾，收集菌株Q2菌絲體進行轉錄組測序，測序服務由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。RNA提取及轉錄組數據分析參照Liu等［16］的方法。

1.3 數據分析

利用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2007軟件對數據進行方差分析、顯著檢驗并作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株Q2對尖鐮孢菌SG－15生長發育的影響

顯微鏡下觀察發現，單獨培養的SG－15菌絲生長正常，產生了較多的小型分生孢子，有些孢子已經萌發（圖1A）；在菌株Q2與菌株SG－15共培養體系中SG－15菌絲形態發生顯著變化，菌絲細胞腫脹呈圓形，菌絲細胞間縊縮，菌絲細胞內油球增多，菌絲內出現紅色物質，僅產生了較少的小型分生孢子，未見孢子萌發（圖1B）。在共培養試驗中，菌株SG－15小型分生孢子在體系中的起始濃度約為2.0×106cfu／mL，在共培養5 d后，T1～T5共培養體系中的菌株SG－15小型分生孢子濃度顯著低于對照處理（CK）（圖1C）。CK處理中菌株SG－15的孢子濃度為1.20×108cfu／mL，T1、T2、T3、T4和T5處理分別為8.20×107、6.73×107、9.83×106、4.33×106cfu／mL和1.77×106cfu／mL。PI染色結果表明，與對照處理（圖1D）相比，共培養體系中熒光強度顯著增強（圖1E），說明PI染料可以透過受損的細胞膜進入細胞，菌株SG－15分生孢子的細胞壁和細胞膜受損。

圖1 菌株Q2對尖鐮孢菌SG－15生長的影響

2.2 菌株Q2的轉錄組分析

在Control和FOM處理的6個轉錄組測序文庫中，獲得36 818萬條Reads，去除帶接頭、低質量的Reads后，總共獲得超過34 397萬個高質量的Reads。所有樣本的Q30值均大于92%。這些數據表明，RNA－seq獲得的數據質量可用于進一步的分析。在樣本Control的測序文庫中，97.76%的序列比對到菌株Q2的基因組中（NCBI登錄號：JABUIS000000000），每個樣本中超過98%的序列被唯一地定位到基因組上。在樣本FOM的測序文庫中，55.45%的序列比對到菌株Q2的基因組中，每個樣本中超過97%的序列被唯一地定位到基因組上。在菌株SG－15誘導下，菌株Q2的基因表達發生顯著變化（圖2A），共有2 664個差異表達基因，占總基因的28.14%，其中1 302個基因上調、1 362個基因下調（圖2B）。

通過GO（gene ontology）分析和KEGG代謝通路分析對差異基因在注釋功能中的分布狀況進行了分析。GO分析將基因劃分為分子功能（molecular functions）、生物過程（biological processes）和細胞成分（cellular components）（圖2C）。在分子功能分類中，差異表達基因（DEGs）主要富集于氧化還原酶活性（oxidoreductase activity，238個基因上調、218個基因下調）和催化活性（monooxygenase activity，34個基因上調、59個基因下調）。在生物過程類別中，差異表達基因主要富集于氧化還原過程（oxidation－reduction process，2 155個基因上調、220個基因下調）和跨膜運輸（transmembrane transport，161個基因上調、127個基因下調）。在細胞成分類別中，差異表達基因主要富集于膜固有組分（intrinsic component of membrane，164個基因上調、159個基因下調）、膜部分（membrane part，187個基因上調、162個基因下調）和膜整體組分（integral component of membrane，161個基因上調、152個基因下調）。由GO分析可知，菌株Q2氧化還原過程及氧化還原酶活性和催化活性較為活躍。

DEGs被注釋到111條代謝通路中，共獲得顯著富集代謝通路27條（圖2D），主要為酪氨酸代謝（tyrosine metabolism，17個基因上調、8個基因下調）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，35個基因上調、1個基因下調）、戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉化（pentose and glucuronate interconversions，14個基因上調、2個基因下調）、苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism，11個基因上調、7個基因下調）、糖酵解／糖異生（glycolysis／gluconeogenesis，20個基因上調、3個基因下調）、檸檬酸循環（citrate cycle，13個基因上調、1個基因下調）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism，9個基因上調、7個基因下調）。這些結果表明，在尖鐮孢菌SG－15誘導下，菌株Q2具有更加活躍的營養物質代謝和能量代謝。

圖2 SG－15菌株誘導下菌株Q2表達差異顯著基因的比較分析

2.3 尖鐮孢菌誘導下菌株Q2幾丁質酶和葡聚糖酶相關基因表達

菌株Q2基因組中共計預測和注釋到9 600個編碼基因，其中在碳水化合物活性酶數據庫（CAZy）中注釋到463個碳水化合物活性酶基因，占總基因數的4.8%，包括200個糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、83個糖基轉移酶（glycosyl transferases，GTs）、2個多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、84個碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）、79個輔助活性酶（auxiliary activities，AAs）和15個碳水化合物結合酶（carbohydrate-binding modules，CBM）。在糖苷水解酶的基因中注釋到30個葡聚糖酶（glucanase）基因和23個幾丁質酶（chitinase）基因。結合菌株Q2基因組在SwissProt數據庫的注釋結果，篩選到了16個葡聚糖酶基因（圖3A）和13個幾丁質酶基因（圖3B）。為研究菌株Q2與尖鐮孢菌菌株SG－15互作過程中葡聚糖酶和幾丁質酶相關基因表達差異，根據轉錄組數據的FPKM值作為基因的相對表達量構建了基因表達熱圖（圖3）。在菌株SG－15誘導下，菌株Q2的幾丁質酶和葡聚糖酶相關基因表現出不同的表達趨勢，其中β－1，3－葡聚糖酶基因（TP1．g228、TP2．g877）和幾丁質酶（TP1．g938、TP4．g281、TP4．g285、TP5．g130、TP5．g819）的表達水平上升。在菌株Q2和菌株SG－15共培養體系中，β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶活性分別為3.40 U／mL和1.97 U／mL，相比于菌株Q2純培養體系中的β－1，3－葡聚糖酶活性（2.51 U／mL）和幾丁質酶活性（1.79 U／mL）提高了35.46%和10.06%（圖4）。

圖3 基于轉錄組數據分析菌株SG－15誘導下菌株Q2葡聚糖酶（A）和幾丁質酶（B）相關基因的表達

圖4 不同條件下菌株Q2產β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶能力

2.4 尖鐮孢菌SG－15誘導下菌株Q2的次級代謝產物相關基因的表達

基于antiSMASH數據庫，在Q2基因組中預測到57個次級代謝物簇、66個核心生物合成基因（core biosynthetic genes），主要包括Ⅰ型聚酮合酶（T1PKS）、非核糖體肽合成酶（NRPS）、β－內酰胺（beta-lactone）、吲哚類（indole）、多萜（terpene）、真菌核糖體合成的和翻譯后修飾的肽（fungal-RiPP）。根據FPKM值構建的基因表達熱圖顯示，在菌株SG－15誘導下，菌株Q2的次級代謝產物相關基因表現出不同的表達趨勢（圖5），其 中TP1．g1012（pentalenene synthase）、TP7．g18（terpene synthase）、TP8．g157（trichodiene synthase）、TP8．g275（polyketide synthase）、TP11．g64（nonribosomal peptide synthetase）和TP17．g126（polyketide synthase）等基因的表達水平顯著提高（P＜0.05）。進一步對以TP17．g126為核心生物合成基因的次級代謝產物簇相關基因進行分析發現，以TP17.g126為核心的次級代謝產物簇包括13個基因，其中8個基因的表達水平在SG－15菌株誘導下顯著提升，經qRT－PCR驗證表明，TP17－124、TP17－125、TP17－126、TP17－127、TP17－128、TP17－129、TP17－130和TP17－131分別提高9.12、8.68、96.68、30.67、31.88、4.53、22.74、8.41倍。但尚未明確TP17．g126基因參與合成的次級代謝產物對SG－15菌株生長的影響。

圖5 基于轉錄組數據分析菌株SG－15誘導下菌株Q2次級代謝產物相關基因的表達

3 討論與結論

籃狀菌屬真菌廣泛存在于土壤和空氣中，是重要的工業酶及色素生產菌，有的種類可應用于植物病害的防控［14，17］。Naraghi等［18］研究表明，從番茄根際土壤分離到的黃色籃狀菌（T．flavus）在室內和溫室條件下對引起番茄枯萎病的大麗輪枝孢（Verticillium dahliae）具有明顯的拮抗作用。本研究中所應用的產紫籃狀菌Q2菌株是一株具有較大開發應用潛力的生防菌株。前期的研究表明，菌株Q2能夠在平皿中抑制包括真菌和卵菌在內的12種植物病原菌的生長和繁殖；在溫室條件下對苦瓜枯萎病、煙草黑脛病、煙草根黑腐病和馬鈴薯莖基腐病等土傳病害具有明顯的預防效果［15］。本研究中，菌株Q2可通過破壞SG－15菌株細胞壁和細胞膜結構抑制其生長和繁殖，隨著菌株Q2接種量的增加，對SG－15生長的抑制程度增加。梁曉潔等［19］研究發現木霉菌株TkonT1和TatrT3可通過破壞尖鐮孢菌菌絲體和消解細胞原生質減輕尖鐮孢菌對油桐的危害。趙欣等［20］研究發現解淀粉芽孢桿菌（B．amyloliquefaciens）HRH317菌株通過破壞串珠鐮孢菌（F．moniliforme）菌絲形態和細胞超微結構抑制病原菌菌絲體的生長。

β－1，3－葡聚糖和幾丁質是真菌細胞壁的重要結構成分，參與了真菌細胞壁建成。尖鐮孢菌細胞壁結構的完整性不僅在菌絲體生長中起著重要作用，而且還決定著其對植物的致病力［21］。真菌菌絲尖端的β－1，3－葡聚糖和幾丁質暴露在表面，易受到β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶的脅迫［22］。許多生防微生物可通過產生β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶破壞病原真菌細胞壁的完整性從而抑制病原菌的生長和繁殖［9］。Ueki等［23］研究表明3株能夠產生β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶的拜氏梭菌（Clostridiumsp.）在共培養條件下可有效抑制尖鐮孢菌的生長繁殖。本研究發現菌株Q2與尖鐮孢菌SG－15菌株共培養中，菌株Q2可有效抑制菌株SG－15的孢子萌發和菌絲生長，且共培養體系的β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶活性顯著高于菌株Q2純培養體系。轉錄組結果表明，在尖鐮孢菌誘導下，產紫籃狀菌Q2菌株的TP1．g228、TP2．g877、TP1．g938、TP4．g281、TP4．g285、TP5．g130和TP5．g819等細胞壁降解酶合成相關基因的表達水平升高。通過以上結果，我們認為產紫籃狀菌Q2菌株產生的β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶參與了菌株Q2對尖鐮孢菌孢子萌發和菌絲生長發育的抑制作用。

籃狀菌大多可產生黃色和紅色的無毒性色素，其主要成分為絲紅素類色素和紅曲紅色素［14］。本研究發現，在尖鐮孢菌誘導下，菌株Q2的物質代謝和能量代謝更為活躍，與Ⅰ型聚酮合酶、非核糖體肽合成酶、β－內酰胺和多萜等次級代謝產物相關的基因表達水平升高。其中以TP17．g126為核心的生物合成基因簇的基因轉錄水平極顯著上升，包括脂肪酸合成酶、轉錄激活因子、聚酮合酶、短鏈脫氫酶、單端孢酶烯3－O－乙酰轉移酶、FAD依賴性單加氧酶和FDA連接的氧化還原酶等，同源性分析表明，TP17．g126為核心的代謝產物簇與紅曲紅素（monascorubrin）生物合成基因簇的相關性較高。同時，我們觀察到，在菌株Q2與菌株SG－15共培養中，菌株Q2產生的紅色物質增多，且在菌株SG－15菌絲和分生孢子中沉淀積累。但目前我們尚不清楚菌株Q2產生的紅色物質是否對尖鐮孢菌具有抑制活性。

產紫籃狀菌Q2菌株對尖鐮孢菌生長的抑制作用是一個綜合的作用機制，本試驗明確了菌株Q2可通過產生β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質酶等細胞壁降解酶破壞尖鐮孢菌SG－15細胞壁的完整性，抑制其生長，但對菌株Q2抑制SG－15生長的其他機制尚不明確。下一步將對菌株Q2的聚酮合酶代謝簇的代謝產物及其功能做進一步分析，明確其對尖鐮孢菌生長的影響。