番茄環紋斑點病毒的研究進展

劉宇艷，張潔，陳勇，魏輝

（1.福建省農業科學院植物保護研究所／福建省作物有害生物監測與治理重點實驗室／農業部福州作物有害生物科學觀測試驗站／福建省作物有害生物綠色防控工程研究中心，福建 福州 350003；2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所／云南省農業生物技術重點實驗室／農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650223）

2005年，中國云南省的番茄（Lycopersicum esculentum）和辣椒（Capsicum annuum）產區爆發了一種新型植物病毒病害，感病的番茄和辣椒果實表面均分布有同心圓狀的斑紋，葉片出現壞死斑，植株褪綠、矮化或無花［1］。Dong等［1］從采集的發病樣品中分離出一種新型正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）病毒，并將其命名為番茄環紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）。目前，該病害主要在我國云南、廣西的番茄、辣椒和煙草產區發生，由介體薊馬以持久增殖型方式傳播，給我國農業生產造成巨大損失。本文對該病毒的生物學特性、地理分布、寄主范圍、危害癥狀、傳播途徑和檢測技術等進行歸納總結，旨在為今后TZSV的研究和防控提供參考。

1 番茄環紋斑點病毒及其傳播介體

1.1 生物學特性

番茄環紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）屬布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）西瓜銀斑病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）血 清 組［1，2］。TZSV是一種RNA病毒，其三個基因組片段從大到小依次為ssRNA－L（負義）、ssRNA－M（雙義）和ssRNA－S（雙義），共編碼4個結構蛋白與2個非結構蛋白。其中，ssRNA－L全長共8 919個堿基，含有1個開放閱讀框（open reading frame，ORF），其互補鏈編碼一個大小約為332.7 kDa的依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNApolymerase，RdRp）。ssRNA－M由4 945個堿基組成，包含兩個ORF，分別編碼大小約為34.4 kDa的非結構蛋白NSm（non-structural protein m）以及大小約為127.4 kDa的糖蛋白Gn／Gc前體蛋白（precursor to the Gn and Gc glycoproteins）［3－5］。ssRNA－S最短，共3 279個堿基，也包含兩個ORF，分別編碼大小約為51.9 kDa的非結構蛋白NSs（non-structural proteins）和大小約為30.6 kDa的核衣殼蛋白N（nucleocapsid protein N）。

1.2 地理分布、寄主與發病癥狀

2005年，TZSV首次發現于中國云南省的番茄和辣椒產區［1］，隨后在廣西等地的多種作物上均有發生［6，7］。TZSV的潛在寄主包括7科總計約25種植物，如番茄、辣椒、煙草（Nicotiana tabacum）和土豆（Solanum tuberosum）等重要的經濟作物［8，9］，以及文殊蘭（Crinum asiaticum）、鳶尾（Iris tectorum）等觀賞花卉植物［10－13］。TZSV可與其他病毒復合侵染作物，如自然情況下，TZSV常與馬鈴薯Y病毒（Potato potyvirus Y，PVY）復合侵染煙草和辣椒，通常復合侵染引起的病毒病害比單一病毒侵染造成的危害更嚴重［14］。

據報道，TZSV引起的病害癥狀與寄主品種、感染階段及環境等因素有關。TZSV在番茄的整個生長期均可侵染危害，感病苗齡越小，發病越嚴重。幼苗受害后一周內即出現頂端壞死，隨后迅速枯萎、死亡［15］；較大的番茄植株感染TZSV后新葉迅速出現淡綠色壞死斑，主脈的一側生長停滯且呈鐮刀形，老葉上則出現大量的環狀壞死斑痕。感染病毒的幼果表面有輕微凹陷的環斑或壞死小環斑，果實通常畸形且保持綠色；成熟果實則可觀察到紅白相間或紅黃相間的同心圓癥狀［1，16］。感染TZSV的辣椒葉片上出現較小的褪綠或壞死斑，莖脈、葉柄和莖的內部則會出現壞死性病變，隨著莖內壞死病變范圍擴大，新葉會出現壞死、脫落，最終導致感病植株死亡；感病果實上也會出現褪綠環斑［1］。感病普通煙的葉片最初出現點狀黃斑，隨后黃斑擴大且周圍逐漸斑枯；后期葉片出現大面積黃化及壞死，葉脈變形、黃化，頂端的新葉皺縮形似鐮刀，嚴重時整個頂部萎蔫壞死［17－19］。鳶尾感病后植株矮化、無花，葉片褪綠泛黃、出現壞死性環斑等癥狀，嚴重影響觀賞價值與經濟價值［11］。

1.3 傳播介體

薊馬類昆蟲是正番茄斑萎病毒屬病毒的主要傳播介體［20］。薊馬取食感病植株后獲毒，病毒在薊馬體內完成侵染循環，再在取食的過程中將病毒傳到健康的寄主植物中。因此，薊馬種群數量決定病害的發生和流行［10］。目前已報道TZSV的介體昆蟲包括西花薊馬（Frankliniella occidentalis）、梳 缺 花 薊 馬（F．shculetzi）、棕 櫚 薊 馬（Thrips palmi）和煙薊馬（T．tabaci）［1，15，21，22］。西花薊馬作為云南省多個地區的優勢種群，是TZSV最為重要的傳播介體［23，24］。

1.4 病毒—寄主植物—介體昆蟲三者互作

轉錄組測序結果表明，TZSV感染煙草12天后會引起煙草植株中2 102個基因差異表達，其中1 518個上調表達，584個下調表達；這些基因的差異表達對植物自身的代謝途徑、氧化還原反應、光合作用、激素調節水平等生命活動產生影響［18］。目前受關注較多的是TZSV引起的植物激素水平改變對介體薊馬生長發育以及趨性行為等的影響。如Zheng等［21］研究發現，西花薊馬取食感染TZSV的番茄和辣椒葉片可引起若蟲發育歷期縮短，若蟲期和蛹期的存活率顯著高于飼養在健康葉片上的薊馬種群，表明感染TZSV的寄主植物有助于提高介體西花薊馬種群適合度。鄭雪等［25］通過Y型嗅覺儀測定西花薊馬的趨性行為，結果表明與健康辣椒相比，西花薊馬偏好選擇感染TZSV的辣椒植株；進一步研究發現，感病辣椒葉片中多種植物揮發物含量顯著增加。此外，TZSV感染寄主辣椒后能顯著抑制植株中水楊酸（salicylic acid，SA）含量及其相關基因的表達水平，辣椒葉片中水楊酸含量的降低可促進介體西花薊馬種群的繁衍，從而有利于TZSV傳播［26］。Chen等［22］在以TZSV侵染的辣椒為寄主植物的競爭體系中，發現西花薊馬試驗種群在更短時間內取代了棕櫚薊馬試驗種群。西花薊馬除自身具有更強的繁殖力，其對棕櫚薊馬生殖干擾也是產生這一現象的重要原因。這些結果表明，TZSV不僅能改變寄主植物揮發物質含量從而吸引介體昆蟲取食，也能抑制寄主植物抗性、提高介體薊馬適合度，最終促進病毒的傳播。

2 檢測技術

分子生物學、血清學、形態學等技術已被應用于TZSV的檢測。（1）分子生物學：通過提取植物樣品或昆蟲樣品的總RNA［27，28］，利用PCR對病原物進行檢測，該方法簡便、靈敏度高、特異性強、結果精準［1，19，24］。徐弢等［29］根據TZSV保守的N基因（GenBank登錄號：13YV639）設計特異性引物，通過優化反應條件和反應體系，構建了TZSV的SYBR Green RT－qPCR檢測方法，該方法具有靈敏度高、特異性好等優點。（2）血清學：通過制備病毒蛋白的對應抗體，結合酶聯免疫吸附測定（ELISA）中的雙抗體夾心ELISA（DAS－ELISA）、斑點ELISA（Dot－ELISA，DELISA）或間接ELISA（I－ELISA）等方法可快速、批量檢測樣品［7，24］。鄭寬瑜等［5，17］分別以TZSV的N蛋白與Gn蛋白多克隆抗體為一抗，以膠體金標記羊抗兔IgGgold（10 nm）為二抗，運用免疫膠體金方法對TZSV病毒顆粒進行負染和標記檢測。田金艷［30］、Chen［31］、Niu［32］等制備了TZSV－N蛋白的單克隆抗體，并在此基礎上研發出可快速檢測TZSV的膠體金免疫層析試紙條（colloidal gold immunochromatographic strip，GICA），該產品在5～10 min內即可特異性的識別TZSV，大大提高了檢測效率。（3）電鏡觀察：通過對樣品的組織液負染或超薄切片后染色，在電子顯微鏡下觀察病毒形態。TZSV為直徑80～120 nm球形封閉的病毒粒子，其在不同的寄主植物或不同植物組織中分布規律存在差異，如在煙草葉片細胞及韌皮部薄壁細胞中多為單個或幾個聚集在內質網池中［33，34］；在甜椒組織內主要呈單個粒子分布；在番茄果實中則散布或呈塊狀、管狀，由囊泡包裹著聚集于細胞內［16，34］。

3 防控策略

蟲媒病毒病防控應以“預防為主、綜合防治”的“防蟲治病”原則和“綠色防控”為導向［35］。

預防措施：（1）合理施肥，加強田間管理和改善作物生長環境以增強作物抗病能力；（2）清除種植區及周邊薊馬類昆蟲的越冬寄主，通過定期噴施農藥或釋放天敵等措施防治薊馬［36］；（3）定期采樣檢測，做到盡早發現，及時處理。

防治措施：薊馬的防治手段多樣［37－39］，主要有：（1）通過釋放天敵控制傳毒薊馬。谷培云等［39］通過在西花薊馬和花薊馬危害較為嚴重的彩椒大棚內釋放巴氏鈍綏螨（Amblyseius barkeri）和劍毛帕厲螨（Stratiolaelaps scimitus）可有效控制薊馬種群數量；東亞小花蝽（Orius sauteri）是多種農業害蟲的天敵，其成蟲、若蟲均能捕食薊馬，對辣椒、茄子田里的西花薊馬種群具有較強的控制效果，在作物苗期釋放東亞小花蝽是生物防治薊馬的有效手段［40，41］。（2）利用微生物防控傳毒薊馬。近年來，一些高毒力蟲生真菌如球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）等已廣泛應用到西花薊馬的生物防治中［42］。（3）利用植物源揮發物或者薊馬信息素，結合薊馬對光波的趨性特點誘殺傳毒薊馬。西花薊馬和煙薊馬對反射波長為430 nm的藍紫光、450 nm的藍色光和562 nm的黃光有較強的趨性，研究表明此類顏色誘蟲板能較好地誘殺薊馬類害蟲［43，44］。此外，研究表明р－茴香醛（p-methoxybezaldehyde）、香葉醇［（2E）-3，7－dimethyl-2，6-octadien-1-ol］、芳樟醇（3，7-dimethylocta-1，6-dien-3-ol）和異煙酸乙酯（ethyl isonicotinate-4-carboxylate）等植物源揮發性物質對薊馬具有誘集作用，并已廣泛應用于田間薊馬類害蟲的誘殺［45］。（4）利用低毒高效殺蟲劑防控傳毒薊馬。Zheng等［21］研究發現質量濃度為0.25 g／L螺蟲乙酯（spirotetramat）對西花薊馬具有較好的致死作用。吡蟲啉與高效氯氟氰菊酯（lambda-cyhalothri）按照7∶3比例復配，對西花薊馬的共毒系數為194.82，具有顯著的殺蟲效果［46］。（5）合理利用抗性資源防控TZSV。龐洪翠［47］研究發現寧夏廣泛種植的‘74－82’和‘嬌龍’辣椒品種屬于西花薊馬高抗品種，西花薊馬在這兩種辣椒品種上種群適合度較低。

4 展望

持久增殖型病毒在介體昆蟲取食感病的植株時病毒粒子通過口針進入昆蟲消化道，隨后病毒在突破昆蟲體內多重組織屏障和免疫屏障后進入唾液腔，當昆蟲再次刺吸植物時，病毒隨著昆蟲的唾液進入寄主植物組織細胞中，實現病毒在寄主植物間的傳播［48］。因此，揭示介體傳播病毒的過程對于制定合理的病害防控策略具有重要意義。目前已有的相關研究主要涉及病毒在寄主植物細胞中的形態及蛋白功能等［3，34］，TZSV在介體薊馬體內的侵入、復制、擴散等機制研究尚待開展。

雖然WSMoV與TZSV氨基酸序列一致性較高，但關于WSMoV的研究較少［49］。近年來，番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的代表種番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的研究較為深入［50－52］，但研究表明TZSV與TSWV各個蛋白在寄主體內的形態及分布模式差異較多。如尚衛娜［3］利用激光共聚焦顯微鏡觀察TSWV和TZSV運動蛋白NSm在煙草表皮細胞和粉蚊夜蛾（Trichoplusia ni）培養細胞Tn中的定位情況，明確了TSWV－NSm可形成小管并延伸至鄰近細胞，而TZSV－NSm則主要以網狀形式聚集于細胞質內，未形成小管；尚衛娜［3］、Zhang［34］等通過透射電鏡觀察到TSWV常以多個粒子聚集的方式包裹在囊泡里，但TZSV常以單個或少數幾個粒子的方式聚集。因此，TZSV與TSWV各個蛋白在寄主體內的功能可能存在差異。目前，僅趙星月等［53］從西花薊馬cDNA文庫中初步篩選到一個與NSs互作的介體蛋白——類電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion-selective channellike，VDAC），但VDAC與NSs互作機制及其功能尚不清楚。由此可見，TZSV與介體昆蟲互作亟需通過試驗驗證。

鄭雪等［25］研究表明，TZSV侵染過的辣椒對西花薊馬有顯著的誘集作用，但其機理尚待研究。因此，鑒定西花薊馬定位感病辣椒關鍵氣味受體或氣味結合蛋白基因，篩選西花薊馬識別感病辣椒的特異性揮發物，可為開展通過調控介體昆蟲行為來控制病毒病提供理論支持。