新城疫強毒特異性反轉錄熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

徐敏麗，于江，逯璐，張玉玉，任素芳，陳智，孫文博，郭立輝，吳家強，張琳

（1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所／山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；2.山東管理學院新興業態發展研究所，山東 濟南 250357）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、高度接觸性的禽類傳染病，是世界動物衛生組織（OIE）規定的法定報告疫病，給許多國家養禽業造成巨大經濟損失［1］。NDV又稱禽副黏病毒1型，在分類上屬于單鏈負股病毒目副黏病毒科副黏病毒亞科的禽腮腺炎病毒屬，其基因組包含6個開放閱讀框，從5′到3′依次編碼L－HN－FM－P－NP共6種結構蛋白［2，3］，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一。病毒毒力的強弱與其裂解位點區的氨基酸序列相關，強毒株氨基酸序列一般為112R／K－R－Q－K／R－R－F117，弱毒株則為112G／E－K／R－Q－G／E－R－L117，氨基酸序列上的差異也成為在基因水平上區分NDV強、弱毒株的靶點。

目前，我國對于新城疫的防控主要依靠疫苗，有效的疫苗和合理的免疫程序很大程度上控制了該病的暴發和流行。但由于我國養殖環境復雜，標準化、規模化養殖水平不一，致使NDV在養殖環境中長期存在［4］，這也給病毒的變異進化提供了條件，不但在宿主范圍和致病性上產生了變化，而且常以非典型病癥呈現［5－7］，所以NDV的鑒定和病例的確診必須經過實驗室診斷。當前，NDV檢測主要使用PCR技術和血清學技術。相比于血清學技術，PCR技術在病毒的快速檢測中具有先天性優勢，不僅耗時短、操作簡便，而且敏感性更高。然而，由于疫苗（滅活疫苗和弱毒苗）的廣泛使用和一些天然弱毒株的存在［8］，從免疫禽類中檢測到的NDV可能是被接種的疫苗病毒或是不至于引起發病的弱毒株，即使檢測和分離到了NDV，也不能確定禽類感染了野毒。所以，準確掌握NDV的感染情況，首先要排除疫苗毒的干擾，能夠快速、準確區分NDV強、弱毒株或者特異性擴增NDV強毒的檢測方法十分必要。

對于區分NDV強、弱毒株的PCR檢測方法已有報道，曹殿軍［9］、胡傳偉［10］、黃淑堅［11］等設計了兩對特異性引物分別擴增NDV強、弱毒株，但所建方法的靈敏度不高；岳華［8］、曹軍平［12］、王珂［13］等分別建立了基于探針法的針對NDV強毒的熒光定量RT－PCR方法，在檢測靈敏度方面有很大程度的提升，但探針的應用使得檢測成本大幅提升，在廣泛應用中受到限制。為此，急需一種低成本、高敏感性的NDV強毒特異性熒光定量PCR檢測方法。本研究基于熒光定量PCR高效、靈敏的優點，以SYBR GreenⅠ染料代替探針，配以特異性引物，建立了基于SYBR GreenⅠ嵌合熒光的NDV強毒特異性逆轉錄熒光定量PCR（reverse transcription fluorescence quantitative PCR，RT－qPCR）檢測體系，能夠為新城疫的監測提供預警信息，從而有效控制NDV強毒感染的發生與蔓延。

1 材料與方法

1.1 毒株

NDV強毒（F48E9）、NDV弱毒（lasota、克隆30、V4）、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis，IBV）、鴨病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）、雞傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis，ILTV）、禽坦布蘇病毒（Avian tembusu virus，ATMUV），均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室分離鑒定并保存。

1.2 試劑

RNAiso Plus、T7 RNA Polymerase、One Step RT－PCR Kit、TB Green PremixEx Taq嵌合熒光法檢測試劑盒、Ex TaqHS，均購自大連寶生物科技有限公司；Simply P病毒DNA／RNA提取試劑盒，杭州博日科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計 根據GenBank中登錄的所有NDVF基因序列，分析強、弱毒區分位點，設計強毒特異性引物對，以達到只擴增強毒而不擴增弱毒的目的。上下游引物序列如下：NDV F realtime－1：5′－TACACCTCATCCCAGACAGG－3′，NDV F realtime－2：5′－AGTCGGAGGATGTTGGCAGC－3′，擴增產物長度為305 bp。另設計合成含T7啟動子的上游序列，NDV F realtime－T7－1：5′－TAATACGACTCACTATAGGGTACACCTCATCCCA GACAGG－3′，用于體外轉錄模板的制備。

1.3.2 核酸提取和體外轉錄模板的制備 提取NDV、AIV、ARV、IBV、DHAV、ILTV和ATMUV的核酸，保存于－80℃備用。以F48E9的RNA為模板，以NDV Frealtime－T7－1、NDV Frealtime－2為引物，經一步法RT－PCR擴增得到的目的條帶作為體外轉錄模板。一步法RT－PCR反應體系為：PrimeScript one step enzyme mix 2μL，2×one step buffer 25μL，NDV F realtime－T7－1引物（100 pmol／μL）1μL，NDV F realtime－2引物（100 pmol／μL）1μL，RNA模板2μL，RNase Free Water補足50μL。一步法RT－PCR反應條件為：50℃反轉錄30 min；95℃預變性2 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32個循環；72℃延伸10 min。

1.3.3 NDV強毒RNA標準品的制備 取1μL體外轉錄模板進行體外轉錄，操作按T7 RNA Polymerase試劑盒說明書進行。產物最終溶解于DEPC水中，并用紫外分光光度計測其濃度，通過公式將得到的RNA換算為拷貝數，并用RNase Free Water進行10倍倍比稀釋，將稀釋的RNA作為標準品，－80℃保存備用。

1.3.4 RT－qPCR反應體系及標準曲線的建立 配制RT－qPCR反應體系并進行引物濃度、退火溫度等條件的優化。反應體系（20μL）：2×One Step SYBR RT－PCR buffer 10μL，Ex TaqHS 0.4μL，Primescript RT enzyme mixⅡ0.4μL，NDV F realtime－1、NDV F realtime－2引物（10～50μmol／L）各1μL，RNase Free dH2O 5.2μL，total RNA 2μL。反應條件：42℃反轉錄5 min；95℃預變性3 min；94℃變性10 s，53～60℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個循環；72℃延伸10 min。其中引物濃度取10、20、30、40、50μmol／L共5個濃度梯度；退火溫度選擇53、55、57、58、60℃，每個反應條件均進行3次重復。結果根據反應的擴增曲線和溶解曲線進行判定。隨后根據反應體系和條件，進行標準曲線的建立，選擇1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103拷貝／μL 6個濃度梯度的RNA標準品作為模板進行RTqPCR擴增，每個濃度的標準品3個重復，擴增后用于標準曲線的建立。

1.3.5 RT－qPCR方法的敏感性 分別以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷貝／μL的RNA標準品作為模板，使用優化的RT－qPCR反應體系進行擴增，能夠有效擴增的最低稀釋度的拷貝數為檢測方法的檢測極值。

1.3.6 RT－qPCR方法的特異性 采用優化的體系和條件，以NDV強、弱毒和其他禽類常見病毒（AIV、ARV、IBV、DHAV、ILTV和ATMUV）的核酸為模板進行RT－qPCR檢測，以確定該方法的特異性。

1.3.7 RT－qPCR方法的準確性 利用建立的RT－qPCR方法對本實驗室保存的NDV陽性樣本（表1，已測定F基因全序列）進行準確性驗證。經RT－qPCR方法擴增，與測序結果相比較以驗證RT－qPCR方法的準確性。

表1 NDV陽性樣本

2 結果與分析

2.1 體外轉錄模板和RNA標準品的制備

以NDV F realtime－T7－1和NDV F realtime－2為引物，F48E9 RNA為模板進行體外轉錄模板的制備。經瓊脂糖凝膠電泳和序列測定顯示，成功獲得F48E9的目的基因片段。分光光度計測得其濃度為3.2×109拷貝／μL，對其進行10倍系列稀釋后，用于標準曲線的建立。

2.2 RT－qPCR反應體系和標準曲線的建立

RT－qPCR反應體系的建立需要在常規體系的基礎上進行條件優化。將引物濃度和退火溫度進行正交試驗，結果顯示，當引物濃度為10 μmol／L、退火溫度為55℃時體系的擴增效率明顯優于其他條件（圖1），且在該反應條件下溶解曲線單一（圖2），確定為反應體系的最優條件。根據反應最佳條件，分別以1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103拷貝／μL濃度梯度的RNA標準品為模板進行RT－qPCR反應，獲取各自的動力學曲線（圖3），各濃度間重復性良好，以此獲得的標準曲線方程為Y＝－3.307X＋2.657（圖4）。

圖1 不同反應條件下的擴增結果

圖2 最佳反應條件下的溶解曲線

圖3 不同濃度標準品擴增結果

圖4 標準曲線

2.3 RT－qPCR方法的敏感性

如圖5所示，RT－qPCR能檢測出的模板最低濃度為1×100拷貝／μL，且陰性對照無擴增，表明該方法的檢測極限值為1拷貝／μL。

圖5 RT－qPCR方法敏感性試驗結果

2.4 RT－qPCR方法的特異性

應用建立的RT－qPCR方法對NDV強毒（F48E9）、NDV弱毒（lasota、克隆30、V4）、AIV、ARV、IBV、DHAV、ILTV和ATMUV進行檢測，結果（圖6）顯示，僅NDV強毒（F48E9）成功被擴增，而NDV弱毒（lasota、克隆30、V4）、AIV、ARV（Ct值＞35）、IBV、DHAV、ILTV、ATMUV則沒有被擴增出。

圖6 RT－qPCR方法特異性試驗結果

2.5 RT－qPCR方法的準確性驗證

利用建立的RT－qPCR方法對25份已明確毒力的病毒進行檢測，結果（圖7）顯示，10株含強毒序列特征的毒株RNA均能有效擴增，而其余毒株RNA則無法擴增，說明該檢測方法準確、可靠。

圖7 RT－qPCR方法準確性驗證

3 討論與結論

NDV F蛋白不僅是介導病毒脂蛋白囊膜與宿主細胞表面融合的主要因子，還是決定病毒毒力的主要蛋白之一。F蛋白最初是以無活性F0的形式存在，在裂解成F1和F2之后，病毒才具有感染性，而F0的裂解能力取決于裂解區的氨基酸組成，如裂解區存在的堿性氨基酸越多，其裂解活性越強，反之則越弱。所以存在兩對堿性氨基酸（精氨酸或賴氨酸）的病毒具有較強的裂解活性，其毒力也較強，而僅存在一對堿性氨基酸病毒的F0蛋白不易被裂解，從而降低了病毒囊膜與宿主細胞膜的融合活性，使病毒感染性降低或者無感染性［14，15］。研究表明，絕大多數的禽源NDV強、弱毒株均符合以上規律，所以根據F基因設計特異性引物用以區分NDV強、弱毒株也是較為普遍的方法。Nidzworski等［16］于2011年設計了一種區分NDV強、弱毒株的RT－PCR方法，但分析序列時發現其體系中的引物無法與后來分離的病毒特異性匹配，即病毒核酸的變異使得該檢測方法失效。本研究引物的設計是基于對所有NDVF基因序列的分析，選擇強毒與弱毒保守但有所區分的位點，能夠保證較長的使用時效，結果也證實設計的引物能夠特異性地擴增強毒RNA，而無法擴增弱毒RNA。

在NDV強毒特異性RT－qPCR檢測方法建立的基礎上努力提高敏感性是本研究的目標之一。一般情況下，NDV感染禽類3天后，典型癥狀才逐步顯現，此階段是病毒復制的對數期，更是控制病毒繁殖與擴散的關鍵期，如能及時檢測到強毒株的存在并采取相應措施，能夠更好地控制疫情的發生。所以，只有高敏感性的檢測方法才能對早期感染做出準確判斷。2000年，曹殿軍等［9］設計的雞NDV強、弱毒株RT－PCR鑒別診斷方法的敏感性僅為500 pg；黃淑堅等［11］設計了兩對特異性引物，建立了區分NDV強、弱毒株的RTPCR方法，其敏感性為10 pg，換算成拷貝數大概為105拷貝，可見常規PCR的檢測靈敏度無法滿足現在的需求。2007年，岳華等［8］報道了基于探針法的NDV中強毒株熒光定量PCR檢測方法，敏感性為60拷貝／μL，較之前有了極大的改善；2012年，檢測體系的靈敏度達到了3拷貝／μL［12］。本研究所建立的NDV強毒特異性RT－qPCR檢測方法的敏感性達到1拷貝／μL，能夠更好地服務于NDV強毒的監測預警。

我國禽類養殖的基數大，且存欄量逐年上升，對于NDV強毒流行情況的大規模檢測，控制成本是重要的環節。本研究使用SYBR GreenⅠ嵌合熒光顯色技術，檢測成本更低，更適合基層及大規模檢測使用。在低成本下實現高敏感性是檢測方法最終的追求，本研究建立的NDV強毒特異性RT－qPCR檢測方法敏感性高、特異性強且成本較低，是NDV強毒監測更為合適的方法和工具。