苦蕎二磷酸尿核苷-半乳糖轉運載體FtUTR的鑒定與分析

石桃雄 汪燕 梁成剛 韋春玉 關志秀 黃娟 朱麗偉

摘要：植物二磷酸尿核苷-半乳糖轉運蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）參與介導UDP-半乳糖的跨膜運輸，對于高爾基體內非纖維素多糖和糖蛋白合成至關重要。為了給苦蕎糖運輸及調控機制研究提供科學參考，本研究基于基因功能注釋與同源基因比對，鑒定到9個苦蕎FtUTR基因，其序列長度在1 920～5 975 bp間，氨基酸殘基在 81～352個間。FtUTR氨基酸序列的一致性為19.14%，說明苦蕎不同FtUTR蛋白間序列保守性較低。但多個苦蕎FtUTR可分別與同源的擬南芥AtUTR聚在一起，說明不同物種間UTR蛋白的進化關系較為緊密。基于莖的轉錄組測序鑒定到5個差異表達基因（DEGs），其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表達;FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表達;FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表達，推測它們可能在幼苗的特定發育階段發揮作用。另外，幼苗發育過程中苦蕎DEGs的表達量存在多個顯著正相關或負相關關系。本研究結果可為下一步深入探索苦蕎FtUTR調控UDP-半乳糖運輸以及生長發育提供基礎。

關鍵詞：苦蕎;二磷酸尿核苷-半乳糖轉運體;蛋白序列分析;基因表達

中圖分類號：S517.01?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0053-05

收稿日期：20201-04-14

基金項目：國家自然科學基金 （編號：32060511）;貴州省科技支撐計劃 （編號：黔科合ZC[2019]2298）;貴州省高層次創新型人才“千層次人才”項目;貴州省蕎麥種質資源保育及創新重點實驗室建設基金（編號：黔教合KY[2017]002）;貴州省研究生教育創新計劃 （編號：黔教合YJSCXJH[2020]100）。

作者簡介：石桃雄（1980—），女，寧夏石嘴山人，博士，副教授，研究方向為蕎麥數量遺傳學，E-mail：shitaoxiong@126.com;共同第一作者：汪 燕（1985—），女，重慶人，博士，副教授，研究方向為蕎麥種質資源創新與遺傳育種，E-mail：yanwanguf@163.com。

通信作者：梁成剛，博士，副教授，研究方向為蕎麥遺傳育種。E-mail：jesselcg@163.com。

二磷酸尿核苷-半乳糖（UDP-galactose）是植物高爾基體內非纖維素多糖和糖蛋白合成的重要前體物質[1-2]。UDP-半乳糖轉運蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）則是介導UDP-半乳糖進行跨膜運輸的重要載體，對于植物的生長發育具有重要作用[3-4]。Khalil等將人類的UDP-半乳糖轉運體基因hUGT1導入煙草，結果發現轉基因煙草植株表現出類似于外源赤霉素噴施的形態特征[5]。Reyes等研究指出，擬南芥中UDP-半乳糖轉運體AtUTr1定位于內質網，體外試驗證實AtUTr1能夠參與UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖運輸[6]。此外，Bakker等鑒定獲得2個擬南芥UDP-半乳糖轉運體基因（UDP-GalT1和UDP-GalT2），互補試驗證實它們具有UDP-半乳糖底物特異性[7]。Rollwitz等則在擬南芥中鑒定到一個新的UDP-半乳糖蛋白AtNST-KT1[8]。Handford等研究發現，擬南芥AtUTr7調控了UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的運輸，進而影響側根的發育[9]。Seino等基于擬南芥UDP-galactose transporter序列比對，鑒定到水稻同源基因，并克隆了4個OsUGT基因，分別編碼350、337、345和358個氨基酸殘基[10];互補試驗證實OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3可參與介導UDP-半乳糖的運輸，而OsUTG4則介導了UDP-葡萄糖的運輸。蘇瑩等基于同源比對鑒定到具有UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖轉運活性的水稻OsURGT1，氨基酸殘基數為331個，可能參與多種激素調控途徑和逆境脅迫調控途徑[11]。

苦蕎是我國的特色雜糧作物，主要種植于西南高寒地區[12]。苦蕎生育期短，同時具有耐貧瘠、耐冷涼、耐干旱等特性，加之其營養保健功能突出，深受人們的喜愛[13-14]。不過，作為一種小宗作物，苦蕎栽培馴化時間短，基礎研究開展較為滯后，開展與苦蕎糖運輸及調控機制的相關研究工作，可為探索苦蕎生長發育與產量形成提供科學參考。本研究首次對苦蕎UDP-半乳糖轉運基因家族FtUTR基因進行篩選、鑒定與生物信息學分析，明確FtUTR基因信息及編碼蛋白理化特性、系統發育關系，并結合轉錄組測序分析苦蕎FtUTR的表達模式等，為苦蕎糖類運輸的分子調控機制等相關研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基于擬南芥TAIR基因庫（https：//www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp）中查詢獲得的AtUTR基因序列和苦蕎轉錄組測序數據庫的基因功能注釋，進行序列同源比對，篩選并鑒定苦蕎FtUTR基因。

1.2 苦蕎FtUTR基因及編碼蛋白的序列分析

登陸NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進行苦蕎FtUTR基因的最長開放閱讀框編碼蛋白（MaxORF）及編碼蛋白的氨基酸序列預測。登陸Expasy網站（https：//web.expasy.org/protparam/）進行苦蕎FtUTR編碼蛋白的氨基酸殘基數、蛋白分子質量、等電點、疏水性和脂肪族氨基酸指數的預測。登陸蛋白結構預測網站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進行苦蕎FtUTR蛋白的跨膜結構功能域預測。利用DNAman軟件分析FtUTR氨基酸序列的保守位點。利用MEGA 5.0軟件Cluster W進行FtUTR氨基酸序列多重序列比對分析，使用Neighbor-joining法進行蛋白聚類分析，重復次數設置為1 000次。

1.3 苦蕎FtUTR基因的表達與相關性分析

試驗于2018年在貴州省蕎麥工程技術研究中心基地進行，在苦蕎出苗后5、10、15 d對基部莖進行轉錄組測序和基因表達分析，并鑒定差異表達基因（DEGs）。利用MeV軟件制作FtUTR基因的表達量熱圖，SPSS 19.0進行FtUTR基因表達量的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 苦蕎FtUTR基因及蛋白序列分析

基于轉錄組測序的基因功能注釋與擬南芥AtUTR序列比對篩選到9個同源苦蕎FtUTR基因。如表1所示，苦蕎FtUTR序列在1 920～5 975 bp間，MaxORF的氨基酸殘基在81～352個間，分子量在8 780.03～39 287.30 u間，等電點在4.88～980間，疏水性在-0.200～0.728間，脂肪族氨基酸指數在72.35～111.03間。跨膜結構域預測發現6個FtUTR的MaxORF跨膜結構域在2～8個間，3個FtUTR的MaxORF蛋白不含有跨膜結構域。

對苦蕎FtUTR的MaxORF蛋白序列進行比對分析，結果發現9個苦蕎FtUTR的MaxORF蛋白序列一致性僅為19.14%。如圖1所示，9個蛋白間不存在完全共同保守位點，僅存在19個相對保守位點，說明FtUTR間氨基酸序列差異較大。

2.2 苦蕎FtUTR蛋白序列分析

利用擬南芥AtUTR蛋白序列與苦蕎FtUTR蛋白序列進行聚類分析，由圖2可知，擬南芥UTR1、UTR3與苦蕎FtPinG0001052700.01、FtPinG0001901300.01被聚為一小類;擬南芥UTR2與苦蕎FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚為一小類;擬南芥UTR6與苦蕎FtPinG0006904300.01被聚為一小類;擬南芥UTR7與苦蕎FtPinG0003694100.01被聚為一小類;另外，苦蕎FtPinG0007731500.01、FtPinG0002689200.01和FtPinG0001931200.01被聚為一小類。

2.3 苦蕎莖發育過程中FtUTR基因的表達分析

基于轉錄組測序，檢測到9個FtUTR基因在苦蕎出苗后5、10、15 d莖中均有表達，DEGs鑒定發現5個FtUTR基因在不同時期莖中差異表達。由圖 3-A 可知，不同時期莖FtUTR基因的表達量變化趨勢不一致，主要存在表達量逐漸升高、逐漸降低、先升高后降低以及相對變化幅度較小的4種變化類型。由圖3-B可知，1個苦蕎FtUTR差異表達基因（FtPinG0001931200.01）在出苗后5 d高表達;2個苦蕎FtUTR差異表達基因（FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01）在出苗后10 d高表達;2個苦蕎FtUTR差異表達基因（FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01）在出苗后15 d高表達，推測不同FtUTR基因可能在莖的特定發育階段發揮功能。

2.4 苦蕎FtUTR基因的相關性分析

對不同時期苦蕎莖FtUTR基因的表達量進行

相關性分析，由表2可知，FtPinG0001931200.01與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈顯著或極顯著負相關關系;FtPinG0002689200.01與FtPinG0001901300.01呈極顯著正相關關系，與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈顯著或極顯著負相關關系;FtPinG0001901300.01與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈極顯著負相關關系;FtPinG0001052700.01與FtPinG0001931400.01呈極顯著正相關關系。

3 討論與結論

植物UTR蛋白介導的UDP-半乳糖跨膜運輸對非纖維素多糖和糖蛋白合成具有重要作用[1-3，15]。基于擬南芥UTR序列，在作物中陸續開展了同源基因的相關研究。例如Seino等克隆得到了水稻OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3、OsUGT4，分別編碼350、337、345、358個氨基酸殘基[10]。本研究基于轉錄組測序的基因功能注釋與擬南芥UTR同源基因進行比對，篩選到9個苦蕎FtUTR基因。其中，FtPinG0001052700.01、FtPinG0003694100.01、FtPinG0001931400.01FtUTR基因分別編碼332、339、352個氨基酸殘基，其余6個FtUTR基因的最長開放閱讀框編碼氨基酸序列較短。跨膜結構預測發現，氨基酸序列較長的FtUTR蛋白含有多個跨膜結構域，雖然3個FtUTR基因的MaxORF不存在跨膜結構域，不過它們的其他ORF編碼蛋白含有跨膜結構域，因此，推測9個苦蕎FtUTR基因均能介導跨膜運輸。

Seino等指出植物中存在多個UDP-半乳糖轉運基因，但相互間進化關系并不緊密[10]。本研究發現，苦蕎9個FtUTR蛋白間序列一致性僅為1914%，且不存在完全共同保守位點，僅含19個相對保守位點，說明苦蕎不同FtUTR蛋白間序列保守性較低。不過，多個擬南芥AtUTR與苦蕎FtUTR被聚在一起，例如擬南芥AtUTR2與苦蕎FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚為一小類，說明不同物種間UTR蛋白的進化關系較為緊密。

本研究發現苦蕎莖不同發育時期9個FtUTR基因表達量變化趨勢不一致，基于轉錄組差異基因分析共鑒定到5個DEGs，其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表達;FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表達;FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表達。苦蕎出苗后5 d，幼苗正處于子葉期，營養物質由地下種子向地上部分運輸，10 d時幼苗正逐步完成由子葉期向真葉期的過渡，而 15 d時植株則完全進入真葉期，因此，推測這些FtUTR可能在幼苗的特定發育階段發揮作用。另外，4個FtUTR基因在莖不同發育時期表達量無明顯變化，表明它們可能在幼苗發育過程中持續發揮作用。相關性研究發現，苦蕎中FtUTR基因中5個DEGs間存在多個顯著正相關或負相關的關系，而其余4個FtUTR基因與其他FtUTR基因間不存在顯著性相關，說明這些DEGs間可能協調發揮功能或相互間存在功能互補現象。本研究為下一步深入探索苦蕎FtUTR調控UDP-半乳糖運輸以及生長發育提供了基礎。

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