二代測序技術和葉綠體基因組在菊花系統學分類和遺傳資源研究中的應用綜述

夏涵涵 雷雪柔 黃臻齊 陳雪燕 杜一鳴 周厚高

摘要：快速發展的簡化基因組測序技術，適用于非模式植物的測序，成本較低、測序性能強，目前被大量應用于園藝植物鑒定和基因組輔助育種。而具有母系遺傳特征的葉綠體基因組，具有多拷貝、結構保守等優點。將葉綠體基因組與二代測序技術結合應用，將成為植物遺傳資源研究的有效手段。本文綜述了二代測序技術和葉綠體基因組在包括菊花在內的園藝植物種質資源研究中的應用，以期為菊花分類和遺傳資源研究提供理論基礎。

關鍵詞：簡化基因組測序;葉綠體基因組;菊花系統學分類;基因組輔助育種;二代測序技術;遺傳資源

中圖分類號： S682.1+10.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0025-04

菊花（Chrysanthemum×morifolium Ramat.），別稱鞠、黃花和秋菊，是菊科多年生草本植物。菊花作為我國的傳統花卉，同時又是世界上四大切花之首，品種繁多，有著3 000余年的栽培史[1]。在唐朝，中國菊花傳到日本，日本人將其與野菊進行雜交;明末清初時期，菊花又經荷蘭商人引種至歐洲栽培，形成花色、花型各異的品種[1]。菊花具有極高的藥用和經濟價值，用途多樣。藥菊如滁菊被研發成了滁菊蜜、 滁菊口含片等，還可利用其黃酮和揮發油等制作新產品[2]。又因其品種豐富，被許多藝術家用于雕塑、插花等藝術作品的制作。如今菊花在世界各地廣泛栽培，栽培技術和條件的提高，更是讓菊花的栽培和應用具有更廣的前景[3]。

1 菊花分類研究進展

1.1 傳統分類階段

菊花起源于中國，關于菊花最早的記載在《周禮》中，此外，周朝至春秋時期均有關于菊花的記載，在秦朝時甚至曾出現菊花銷售市場[4]。菊花具有極高的藥用價值，古人最早是以食用、藥用的目的來栽培菊花的，在我國關于菊花最早的分類在《本草經》中，將其分為真菊和苦薏[5-6]。晉朝陶淵明獨愛菊，創作了許多贊美菊花的詩句，菊花被當作觀賞植物開始廣泛栽培。宋朝是栽培菊花的盛期，隨著栽培技術的提高，出現了各種不同花色的菊花，人們開始以花色來對菊花進行分類[5]，宋朝各菊譜記載的品種也越來越多。明清時期還是按照宋朝的方法利用花色來對菊花進行分類[5]。但是，由于古代技術的缺乏和局限，并未能對菊花進行很詳細的記載和研究，菊花品種也沒有被科學系統地分類，僅記載了一些類別。

1.2 形態學系統分類整理階段

我國第1次對菊花進行系統分類的是南京農業大學李鴻漸教授，他經研究整理后發現我國擁有 3 000 多個菊花品種[7]。形態學系統分類整理階段對菊花品種進行分類的依據主要是花形、花色、瓣型等，各學者提出了不同的分類方案。湯忠皓提出將菊花分為22區、2花型、7瓣型和30個花型的四級方案[8]，張樹林提出將菊花品種歸為2系、3瓣型、25花型的三級分類方案[9]。李鴻漸教授等發布了與全國菊花品種分類研討會相似的分類方案，將大菊品種分為5類、42型[10]。

1.3 現代綜合分類階段

現代的菊花分類依據除了形態學性狀之外，還有細胞學及分子生物學等性狀，可以對菊花進行更深入、更細致的分類學研究。傅玉蘭對寒菊新品種進行花粉形態研究，證實菊花外部形態特征與花粉形態的遺傳變異具有一定的相關性[11]。陳發棣等對幾種中國野生菊進行減數分裂研究發現，野菊為異源四倍體[12]。分子標記技術在菊花種質資源研究中的應用為菊花的起源、菊屬植物種間的親緣關系、菊花品種的遺傳多樣性研究及菊花的品種分類和鑒定提供了豐富可靠的參考數據。不同的分子標記技術[如隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）和簡單重復序列間區（ISSR）等]對菊花品種分類均起到了重要作用，如戴思蘭等曾用RAPD技術對菊花起源進行研究發現，野菊、毛華菊與栽培菊花的親緣關系最接近[13]。許多研究提出，瓣型在菊花起源中是一個重要的性狀，并可作為菊花分類的一個等級[14]。此外，這些標記技術不僅可以將菊花的原始栽培品種區分開來，還可以區分從一個品種中衍生出來的突變體，這就為今后菊花品種鑒定和培育工作提供了技術支持。

1.4 存在的問題

前人雖然已經在中國菊花品種形態分類和鑒定方面做了大量工作[15-16]，但是對于品種數量眾多的菊花來說，制定全面系統的分類鑒定方案非常困難，在品種分類和遺傳資源研究方面都存在很大的不足和局限。一是由于菊花品種間差異較小、遺傳復雜及高度的自交不育性，加大了菊花研究的難度。二是菊花品種收集和保存難度大，菊花品種繁多，易雜交產生新的變異，缺乏直接有利的生物分子信息[17]。三是菊花分類體系和鑒定手段不完善，目前主要仍以形態特征作為分類依據，受自然環境的影響較大。尋找穩定的遺傳標記、有效地鑒定菊花品種是今后菊花品種資源研究的重要課題，應重視分子生物學方向的研究，用不同的分子標記技術進行菊花品種研究。

2 葉綠體基因研究進展

葉綠體是部分藻類及高等植物特有的、具有雙層膜結構的半自主性細胞器，其最重要功能就是通過光合作用合成重要氨基酸類物質并產生能量，是植物體重要的能量轉換器[18]。葉綠體基因組即葉綠體DNA（cpDNA），包含葉綠體中所有的DNA。自Shinozaki等成功獲取煙草（Nicotiana tabacum）的葉綠體基因組全序列以來，越來越多的植物葉綠體基因組序列被測定[19]。葉綠體基因組庫中含有同一個種的不同亞種葉綠體基因組序列，反映了它們之間存在進化差異[20]。由于葉綠體基因組具有比較保守的環狀結構、獨立的基因組及屬于母系遺傳，使得葉綠體轉化技術成為研究植物進化研究的有效手段。

2.1 葉綠體基因組結構

葉綠體基因組序列的基因組大小、結構、種類的保守性都很強，絕大部分葉綠體DNA為雙鏈閉合環狀分子，極少數是線狀，如傘藻（Acetabularia）和玉米（Zea mays）。葉綠體基因組的大小一般為 120～160 kb，也存在同一物種大小差異過大的情況，如綠藻的葉綠體DNA的差異很大，小的如某種寄生性綠藻（Simulium jonesii）的DNA大小只有 37 kb，而大的如傘藻的DNA大小則達2 000 kb[21]。cpDNA有4個基本組成部分，雖然不同植物的葉綠體DNA長度各不相同，但大部分植物葉綠體中均有1段大致為10～24 kb且呈反向重復的DNA序列（IRA、IRB）。除此以外，IRA和IRB之間發生重組形成了小單拷貝序列（small single copy region，簡稱SSC），剩下的部分就是大單拷貝序列（large single copy region，簡稱LSC）。IRA、IRB大小和方向的不同是造成cpDNA差異的主要原因，如被子植物豌豆（Pisum sativum）甚至已經失去IR區間，而纖細裸藻（Euglena gracilis）含有3段方向相同的重復DNA序列，紫紅紫菜（Porphyra purpurea）的IR序列同向重復[20]。葉綠體基因組編碼的基因可大致分為3類，分別是光合系統基因（psaA、psaB、psaC、petA、petB、atpA等）、遺傳系統基因（rrn5、trnH、rpl2等）、生物合成基因（matK、cemA等）。

2.2 葉綠體基因組在園藝作物研究中的應用

隨著基因組學的發展，葉綠體基因組憑其自身特點和優勢已經成為基因組測序的首要選擇，在植物的系統發育分析中有巨大優勢。如段義忠等通過葉綠體基因組對比分析沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）和小沙冬青（A. nanus）在蝶形花科中的系統進化發育[22]。楊嘉鵬等對3種石豆蘭屬藥用植物葉綠體基因組進行組裝注釋，為系統發育分析和物種鑒定提供了理論依據[23]。趙惠恩對菊花的cpDNA基因序列中的trnT-trnL、trnL-trnF序列進行研究，發現毛華菊（C. vestitum）和栽培菊花的序列差異較大，而栽培菊花和甘菊（C. lavandulifolium）的序列完全相同，由此可見，栽培菊花的母系祖先種可能是甘菊，并非毛華菊[24]。李世茂采用葉綠體基因間隔序列對比分析法探討研究栽培菊和野生近源種的系統學，為栽培菊的起源提供了理論依據[25]。劉錫娟等在試驗中通過用菊花Rubisco小亞基的啟動子驅動，在基因的5′端加葉綠體定位信號肽，構建了植物表達載體并進行其他轉基因方面的試驗，獲得轉5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因抗草甘膦煙草和棉花[26]。何熠將菊屬、亞菊屬葉綠體DNA測序組裝后，分別進行結構分析，發現菊屬、亞菊屬不同物種之間的差異很小[27]。通過基因組大小比對，發現它們的葉綠體基因組長度十分相似，都在151 000 bp左右，表明該物種全含有相同的一套編碼基因。

3 基因組測序技術方法

3.1 二代測序技術

1977年Sanger等發明的雙脫氧鏈終止法（即第1代DNA測序技術）是獲得植物全基因組最傳統的DNA測序技術[28]。Sanger測序法的測序程序是根據DNA復制和RNA反轉錄的原理來設計的。人們利用該技術第1次獲得了擬南芥的全基因序列[29]。基于Sanger測序發展起來的二代測序技術（next generation sequencing，簡稱NGS）目前已被廣泛應用于觀賞植物分子標記、圖譜構建等[30-31]。二代測序技術主要有Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺、454測序技術、寡聚物連接檢測（SOLiD）測序技術、完整基因DNA測序方法（complete genomics）測序方法、半導體測序技術等5種測序技術。雖然Sanger測序法能夠高準確性地完成大量測序工作，但其存在成本高、速度慢、通量低等不足，而二代測序技術則是一種低成本、高通量的測序技術，1次可對成千上百萬條DNA分子同時進行快速測序，故NGS逐漸取代Sanger測序法而被廣泛應用。 如北美云杉（Picea sitchensis）的葉綠體基因組序列就是通過此方法獲得的[32]，胡志剛利用454測序技術結合標簽法獲得了菊科藥用植物的葉綠體基因組全序列[33]。隨著二代測序的運用，發展出來的簡化基因組測序應用更加廣泛，它是通過選擇一種限制性內切酶進行酶切，然后進行文庫片段大小選擇，使用一定大小的酶切片段所對應的序列作為整個基因組序列的部分代表來降低基因組的復雜性。對群體中不同基因型的個體采用相同的內切酶進行酶切，回收相同大小范圍的酶切片段建立文庫，然后進行高通量測序。對于有參考基因組序列的物種，可進行測序片段的比對;而對于沒有參考序列的物種，則先組裝序列然后進行序列比對。通過簡化基因組測序和分析，可以準確發現單核苷酸多態位點（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）。王柏柯等利用簡化基因組測序對 60個特定番茄樣本進行測序和分析，共獲得8個與目標基因相關的候選區域，對番茄雄性不育基因進行初步定位，為雄性不育基因的克隆功能提供理論基礎[34]。張珊珊等對從24個天然的云南藍果樹樣本進行基因測序中獲得6 309 個有效SNP位點進行遺傳分析，得出了現存植株之間親緣關系較遠的結論，認為該品種的種質資源具有很大的保存價值和研究價值[35]。由于全基因組測序對于像菊花這樣大基因組的物種仍然很困難，而其他的一些遺傳簡化方法具有很高的偏差和限制[36]，因此對于很多非模式的物種，簡化基因組測序技術仍然是一種經濟且有效的途徑來產生高密度的SNP，可以用來對園藝作物進行鑒定和分類，完成基因組輔助育種。周春玲通過AFLP技術對菊屬12個分類群體進行分析，結果表明，滁菊、毫菊2個品種可歸并為1個品種，且與毛華菊、野菊、甘菊的親緣關系較近[37]。洪亞輝等利用RAPD技術對5種菊花變異種后代進行遺傳差異分析，從中發現6種引物的多態差異性明顯，結果表明，變異菊花在DNA水平上具多態差異性[38]。葉松選用99種菊花對其進行高通量測序分析，得到簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）片段 32 863 條，隨機篩選的100對SSR引物中有16對SSR引物具有多態性，且擴增條帶清晰[39]，為分子標記輔助育種在菊花的研究上提供了有效的理論依據。

4 展望

菊花的起源和系統學的研究已經持續了很多年，但由于菊花品種繁多、品種差異較小和技術、歷史的局限性，并未能很好地解釋菊花分類及系統關系，存在較大的分歧。雖然前人已經有進行深入到DNA序列方向的研究，但目前有關于菊花葉綠體基因組序列的研究仍比較缺乏。葉綠體的基因屬于母性遺傳，具有獨立的遺傳系統。與核基因組相比，其結構和基因組成非常保守，具有多拷貝、進化速率適中、在分子水平上具有明顯差異等優點[40]。利用cpDNA對菊花品種的系統進化研究具有很大的潛力，近年來測定葉綠體基因組序列也成為了系統進化和物種分類強力有效的手段。但群體間存在雜交現象，而cpDNA屬單親遺傳，故其無法解釋全部的系統發育現象，也無法揭示完整的進化過程。

隨著科技的發展，NGS憑借其測序性能強、周期短、無需參考基因組等優點，一躍成為探究植物全基因組序列、遺傳多樣性的有效技術。因此，結合簡化基因組測序技術，可獲取更多的遺傳信息和不同水平的區分特征，葉綠體基因組和簡化基因組測序技術可更廣泛地運用在園藝作物鑒定和分類上，輔助分子育種，對園藝作物進行種質創新和品種改良具有重要意義。

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