鳳岡綠茶中有效成分的提取工藝

盧利平 丁功濤 劉苗 張利 楊舜銓 高丹丹 臧榮鑫

摘要：以鳳岡綠茶為原料，探討并確定沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG提取的最佳工藝條件。在甲醇濃度、浸提溫度、浸提時間、料液比4個單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計和高效液相色譜法（HPLC）檢測，以沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量為指標確定最佳工藝參數。結果表明，各有效成分的最佳提取工藝條件為：甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時間40 min，料液比為1 ∶ 30（g/mL）;此工藝條件下得到鳳岡綠茶浸提液中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量分別為（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g，精密度、重復性和回收率的RSD均小于5%。該結果可為鳳岡綠茶的進一步研究提供理論基礎，也為開拓其茶保健產品提供參考依據。

關鍵詞：鳳岡綠茶;提取工藝;正交試驗;HPLC;沒食子酸;咖啡因;可可堿;EGC;EGCG

中圖分類號： TS272.2;TS201.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0170-06

多酚類物質是茶葉中主要的功效成分，包括兒茶素、黃酮醇及其配合物、無色花青素、酚酸及縮酚酸等[1]，兒茶素類物質占茶多酚總量的60%～80%，主要包括兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等單體物質，具有抗氧化、抗突變、抗癌[2]、抗衰老、降血脂、抑菌和抑制病毒等功效[3-4]。沒食子酸是茶葉中一種重要的酚酸類物質，可能與某些茶類的保健功效有密切關系[5]。生物堿主要包括咖啡因、可可堿和茶堿[6]，這些成分是茶湯重要的滋味物質[7-9]，在茶葉的保健功效和分類品鑒上起到重要作用[10]。茶葉中的有效成分是評價和控制茶葉質量的標準，可以快速鑒定茶葉品質[11]。綜合國內外對沒食子酸、咖啡因、可可堿、兒茶素等的檢測方法分析得出[12-14]，高效液相色譜法因其應用廣泛、靈敏度高、精確度好且技術成熟等成為主要的檢測方法[15-18]。

武陵山片區生態條件優越，是優質茶葉的歷史產區，而且多以春茶采摘為主[19]。貴州省遵義市鳳岡縣茶葉生產已成為當地山區茶農的主要收入來源[20-21]，但茶資源利用率不高，有關鳳岡綠茶有效成分的提取技術文獻鮮有報道[22]。本研究通過對鳳岡綠茶中的提取工藝條件進行優化，利用高效液相色譜（HPLC）同時測定沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量，為進一步研究鳳岡綠茶的保健功效提供理論依據，同時為武陵山片區鳳岡綠茶深加工產品的生產及產品質量控制提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG均為分析純，購自成都德思特生物技術有限公司;甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純，購自奧科生物技術有限公司;鳳岡綠茶，購自貴州省鳳岡縣婁山春茶葉專業合作社;娃哈哈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Agilent Technologies 1200 高效液相色譜儀（DAD 檢測器）、Lichrospher C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），購自美國Agilent公司;HWS28型LCQ電熱恒溫水浴鍋、BWS-0505型恒溫水槽水浴鍋，購自上海一恒科學儀器有限公司;Dor Yang DA型電子分析天平，購自渡揚精密儀器（上海）有限公司;WJX-200型高速多功能粉碎機，購自上海緣沃工貿有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶粉的預處理 將茶葉在粉碎機中粉碎后過 40目篩，稱取一定質量的茶粉于50 mL離心管中，加入預熱過的浸提溶劑5 mL，立即轉入水浴中浸提一定時間，冷卻至室溫，在12 000 r/min轉速下離心10 min后收集上清液，重復浸提1次，合并所得上清液。準確取上清液2 mL于5 mL容量瓶中，稀釋并定容至刻度，過0.22 μm膜，即為待測液。

1.3.2 高效液相色譜條件選擇[22-23] 利用高效液相色譜儀對待測液進行檢測，流動相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（10 g/L），去離子水定容至1 L;流動相 B：800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA溶液（10 g/L），以去離子水定容至1 L，流動相A、B液需過0.22 μm膜。綜合考慮測定波長為278 nm、柱溫35 ℃、流速為1.0 mL/min，進液量為10 μL。待流速和柱溫穩定，基線跑平后，序列運行并作空白對照，測試液以峰面積定量。梯度洗脫條件[24]見表1。

1.3.3 標準溶液的配制 將25 mL EDTA溶液（10 g/L）、25 mL抗壞血酸溶液（10 g/L）、50 mL乙腈以去離子水定容至500 mL，制得穩定溶液。準確稱取沒食子酸標準品0.02 g，以穩定溶液溶解于 10 mL 容量瓶并定容至刻度，沒食子酸標準儲備液濃度為2 mg/mL;分別移取沒食子酸儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6個10 mL容量瓶中，用穩定溶液溶解并定容至刻度，沒食子酸標準品溶液濃度分別為0、40、80、120、160、200 μg/mL。咖啡因、可可堿、EGC、EGCG標準品溶液配法同上。

1.3.4 提取工藝條件的單因素試驗 （1）甲醇濃度對提取工藝的影響。在料液比為1 g ∶ 25 mL，浸提溫度為70 ℃，浸提時間為30 min，甲醇濃度（甲醇水溶液）分別為0、65%、70%、75%、80%、85%的條件下，利用HPLC檢測沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。（2）浸提溫度對提取工藝的影響。在料液比為1 g ∶ 25 mL，浸提時間為 30 min，甲醇濃度為70%，浸提溫度分別為55、60、65、70、75 ℃ 的條件下，利用HPLC檢測沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。（3）浸提時間對提取工藝的影響。在料液比為1 g ∶ 25 mL，甲醇濃度為70%，浸提溫度為70 ℃，浸提時間分別為10、20、30、40、50 min的條件下，利用HPLC檢測沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。（4）料液比對提取工藝的影響。在甲醇濃度為70%，浸提溫度為70 ℃，浸提時間為40 min，料液比分別為1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35（g ∶ mL）的條件下，利用HPLC檢測沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量。

1.3.5 正交試驗設計 通過單因素試驗結果分析確定正交試驗條件范圍，選取甲醇濃度、浸提溫度、浸提時間、料液比作為工藝優化的響應值，工藝優化試驗選取甲醇濃度、浸提溫度、浸提時間、料液比4個因素進行L9（34）水平正交試驗，分析各因素對沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG浸出量的影響，以期獲得沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG浸出量均高的組合，正交試驗設計見表2。

1.3.6 方法學考察 取1份待測茶樣，按上述提取工藝優化條件操作，HPLC連續測定5次，評價方法的精密度;取同一批6份鳳岡綠茶茶粉，按照上述提取工藝優化條件處理，進行重復性考察，評價方法的穩定性;在已知各組分濃度的茶粉中加入不同濃度相對應的標準品，評價方法的回收率。精密度、重復性及回收率均用相對標準偏差（RSD）來衡量。

RSD=s/x×100%。

式中：s表示標準偏差;x表示平均值。

1.4 數據分析

數據處理采用Excel 2016軟件，制圖采用Oiginpro 8.0軟件。每組試驗重復3次，結果以平均值作為最終的測量值（SPSS 16.0分析數據之間的顯著性差異）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

在既定的高效液相色譜條件下，各標準溶液，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG相應的峰面積值（y）與濃度（x）的線性回歸方程及相關系數見表3。可知，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的濃度與對應峰面積呈良好的線性關系，其相關系數均在0. 999以上。

2.2 單因素試驗

2.2.1 甲醇濃度對提取工藝的影響 由圖1可知，隨著甲醇濃度的增加，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量曲線先緩慢上升后趨于平緩，其中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC的增長趨勢相對于EGCG較為平緩。當甲醇濃度為0，即選擇純水做浸提溶劑時，雖然能檢測到各組分的浸出量，但是檢測量都比較低;當甲醇濃度為70%時，EGC、EGCG含量達到最大值，這與國標法GB/T 8318—2008《食品添加劑 生姜（精）油（蒸餾）》里提取劑為70%甲醇的條件[24]相一致。繼續增加甲醇濃度，各組分的浸出量略有下降，EGC的下降程度明顯高于其他物質，可見甲醇濃度對EGC的影響較大。經過綜合考慮單因素結果，選擇甲醇濃度為70%、75%、80%做正交試驗設計。

2.2.2 浸提溫度對提取工藝的影響 由圖2可知，在一定溫度范圍內，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量隨著浸提溫度的升高不斷增加，咖啡因、EGC、EGCG的增長趨勢較為明顯;當浸提溫度達到70 ℃時，EGCG浸出量達到最大值，為130.95 mg/g即約占13.10%;在同樣溫度下浸提道泉雅女茶EGCG含量最大為6.04%[25]，可見鳳岡綠茶中EGCG的含量相對較高;繼續升高溫度各組分含量增長較為平緩且咖啡因、EGC、EGCG略微有下降趨勢。究其原因，茶葉提取工藝過程其實是各組分向浸提溶劑擴散的過程，隨著溫度的升高，擴散速度逐漸提高，但當溫度高于某個特定值后，EGC、EGCG易發生氧化作用，測定值略有降低，繼續升高溫度對浸出量的影響不大。經過綜合考慮單因素結果，選擇浸提溫度65、70、75 ℃做正交試驗設計。

2.2.3 浸提時間對提取工藝的影響 由圖3可知，當浸提時間為10 min時，各組分浸出量都較低;浸提時間超過30 min后，可可堿和沒食子酸浸出量增加緩慢;當浸提時間達到40 min時，咖啡因、EGC、EGCG浸出量達到最大值，而后EGC、EGCG浸出量均有明顯的下降趨勢，可能隨著浸提時間延長，EGC、EGCG部分發生氧化作用，測定值降低。經過綜合考慮單因素結果，選擇浸提時間30、40、50 min做正交試驗設計。

2.2.4 料液比對提取工藝的影響 由圖4可知，隨著浸提溶劑的增加，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量先緩慢增加后趨于穩定;當料液比達到1 g ∶ 25 mL時，咖啡因、EGC、EGCG浸出量達到最大值;繼續添加浸提溶劑，各組分浸出量變化不大。究其原因，茶粉中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的含量是一定的，當料液比到達一定值后，各組分浸出量已達到最大值，繼續添加浸提溶劑，部分EGC與EGCG由于高溫發生氧化作用而使測定值偏低[20]。經過綜合考慮單因素結果，選擇料液比1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 35 mL做正交試驗設計。

2.3 正交試驗設計

在L9（34）水平正交試驗設計中進行4因素3水平試驗，正交試驗結果見表4。可以看出，影響鳳岡綠茶中沒食子酸浸出量的因素主次順序為B>D>C>A，即浸提溫度>料液比>浸提時間>甲醇濃度;最佳浸提組合為A2B3C3D1，即甲醇濃度75%，浸提溫度75 ℃，浸提時間50 min，料液比 1 g ∶ 25 mL。影響咖啡因浸出量的因素主次順序為D>A>C>B，即料液比>甲醇濃度>浸提時間>浸提溫度;最佳浸提組合為A1B2C2D1，即甲醇濃度70%，浸提溫度70 ℃，浸提時間40 min，料液比 1 g ∶ 25 mL。影響可可堿浸出量的因素主次順序為A>B>C>D，即甲醇濃度>浸提溫度>浸提時間>料液比;最佳浸提組合為A1B1C3D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時間50 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。影響EGC浸出量的因素主次順序為A>B>C>D，即甲醇濃度>浸提溫度>浸提時間>料液比;最佳浸提組合為A1B1C2D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時間40 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。影響EGCG浸出量的因素主次順序為C>B>A>D，即浸提時間>浸提溫度>甲醇濃度>料液比;最佳浸提組合為A1B1C2D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時間40 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。

將甲醇濃度70%增大到75%，沒食子酸浸出量增加了0.07 mg/g，可見其影響并不明顯，故選取甲醇濃度為70%;在65、70、75 ℃的浸提溫度梯度內，綜合考慮各組分浸出量變化結果，選取浸提溫度為65 ℃;浸提時間從40 min延長至50 min，沒食子酸和可可堿在浸提溶劑中的含量分別相對持平，故選取浸提時間為40 min;單獨考慮1 g ∶ 25 mL到 1 g ∶ 35 mL料液比的變化，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量變化很小，且可可堿、EGC、EGCG在料液比為1 g ∶ 30 mL時取得較高浸出量，故最終考慮選取料液比為1 g ∶ 30 mL。綜合考慮選擇浸提的最佳工藝組合為A1B1C2D2，即甲醇濃度70%，浸提溫度65 ℃，浸提時間 40 min，料液比1 g ∶ 30 mL。

2.4 樣品驗證試驗

對確定的最優浸提條件，即甲醇濃度為70%、浸提溫度為65 ℃、浸提時間為40 min、料液比為 1 g ∶ 30 mL，進行驗證試驗，測得沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量分別為（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g。在優化工藝條件下，鳳岡綠茶中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的綜合提取率相對較高。張俊英等的研究表明浸提鳳岡鋅硒茶時甲醇濃度優化結果為70%，這與本研究部分結果[22]相吻合。

2.5 方法學考察

由表5可以看出，對于精密度考察，HPLC檢測鳳岡綠茶中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的相對標準偏差（RSD）分別為0.5%、0.4%、0.8%、0.4%、0.5%，符合國標GB 5009.12—2017中規定的精密度要求[26]。對于重復性的考察，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的相對標準偏差分別為0.6%、1.3%、1.6%、1.6%、1.2%，表明此方法有較好的重復性。對于回收率的考察，沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的相對標準偏差分別為0.6%、1.5%、1.8%、2.3%、2.3%，表明此方法有較高的準確性。精密度、重復性和回收率的RSD均小于5%，表明儀器精密度良好，方法重復性好，結果準確性高[22]。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計對鳳岡綠茶中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的提取工藝條件進行了優化，確定鳳岡綠茶中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的最佳浸提工藝參數：甲醇濃度為70%、浸提溫度為65 ℃、浸提時間為40 min、料液比為1 g ∶ 30 mL。在此優化工藝條件下，HPLC測得沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量分別為（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g。該結果表明，通過對其提取工藝條件進行優化，相比較鳳岡鋅硒茶[22]，鳳岡綠茶中沒食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG溶出更徹底。精密度、重復性和回收率的RSD均小于5%，表示該方法測定效果良好，結果準確有效，可為更全面地反映鳳岡綠茶品質提供一定的數據基礎，同時為進一步研究相關茶保健品提供理論依據，對提高鳳岡綠茶的利用率具有重要意義。

參考文獻：

[1]趙 磊，高 民，馬燕芬. 茶多酚的抗氧化作用及其機制[J]. 動物營養學報，2017，29（6）：1861-1865.

[2]Yang C S，Li G X，Yang Z H，et al. Cancer prevention bytocopherols and tea polyphenol[J]. Cancer Letters，2013，334（1）：79-85.

[3]王 琳. 茶葉中有效生化成分高效液相色譜檢測法的建立及其在鳳凰烏龍茶檢測中的應用[D]. 南京：南京農業大學，2010.

[4]Singh B N，Shankar S，Srivastava R K. Green tea catechin，epigallocatechin-3-gallate （EGCG）：mechanisms，perspectives and clinical applications[J]. Biochemical Pharmacology，2011，82（12）：1807-1821.

[5]郭俊凌，李成亮，鄭怡萌，等. 茶葉中沒食子酸含量測定的離子化萃取分離分光光度法研究[J]. 食品科學，2010，31（4）：150-155.

[6]馬存強，周斌星，王洪振，等. 普洱茶渥堆發酵中可降解咖啡堿真菌菌株的篩選和鑒定[J]. 茶葉科學，2017，37（2）：211-219.

[7]Heckman M，Weil J，Gonzalez D E. Caffeine （1，3，7-trimethylxanthine） in foods：a comprehensive review on consumption，functionality，safety，and regulatory matters[J]. Journal of Food Science，2010，75（3）：R77-R87.

[8]李海霞，陳 榕，周 丹，等. 咖啡因的合成及其藥理作用的研究進展[J]. 華西藥學雜志，2011，26（2）：182-187.

[9]李 媛，林 青. 茶堿類藥物的研究進展及應用[J]. 中國醫藥指南，2013，11（4）：421-422.

[10]涂小珂，梁 宏，吳鳳琪，等. 超高效液相色譜法同時測定茶葉中兒茶素、酚酸及生物堿[J]. 中國衛生檢驗雜志，2013，23（16）：3167-3169.

[11]王 偉，季曉暉，李秀峰，等. HPLC法同時測定茶葉中多酚、咖啡因和維生素C[J]. 分析試驗室，2014，33（12）：1443-1446.

[12]高 俊，夏 濤，朱 博，等. HPLC-PDA對茶葉中茶氨酸、兒茶素和生物堿的同時分離檢測研究[J]. 安徽農業大學學報，2008，35（3）：324-328.

[13]凌 云，趙云峰，李志軍，等. 茶葉及茶飲料中兒茶素和咖啡因的多組分HPLC分析方法[J]. 衛生研究，2005，34（2）：187-190.

[14]李銀花，李 娟，龔 雪，等. 高效液相色譜法同時測定茶葉中8種兒茶素、3種嘌呤堿和沒食子酸[J]. 食品科學，2011，32（18）：214-217.

[15]黃 鴻，夏曉艷，趙余慶. 茶葉中茶氨酸、咖啡因和茶堿檢測方法的研究進展[J]. 沈陽藥科大學學報，2018，35（8）：696-706.

[16]彭 靜，孫威江. 茶湯中兒茶素與生物堿測定的HPLC法及其優化[J]. 南方農業，2017，11（13）：1-6.

[17]王麗麗，陳 鍵，宋振碩，等. 茶葉中沒食子酸、兒茶素類和生物堿的 HPLC檢測方法研究[J]. 福建農業學報，2014，29（10）：987-994.

[18]馬海建，王利娟，江晨舟，等. 固相萃取-高效液相色譜法測定保健食品中8種皂苷化合物含量[J]. 江蘇農業學報，2020，36（3）：743-750.

[19]李賽君. 湖南武陵山片區優質茶葉產業建設的思考[J]. 茶葉通訊，2013，40（2）：24-26.

[20]彭福元. 武陵山區宜茶的農業地質背景分析[J]. 湖南農業科學，2006（3）：55-56.

[21]常碩其，張亞蓮，李賽君，等. 優質綠茶生產的理論與實踐Ⅱ優質綠茶品種[J]. 茶葉通訊，2008，35（3）：16-20.

[22]張俊英，馮發青，李 霞，等. HPLC法對鳳岡鋅硒茶中九種品質成分的同時測定[J]. 湖北農業科學，2014，53（17）：4175-4178.

[23]中華全國供銷社合作總社杭州茶葉研究院. 茶 咖啡堿測定：BG/T 8312—2013 [S]. 北京：中國標準出版社，2013.

[24]中華全國供銷社合作總社杭州茶葉研究院. 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法：BG/T 8313—2008 [S]. 北京：中國標準出版社，2008.

[25]鄭 琳，高世偉. 道泉雅女茶中茶多酚和EGCG的提取工藝研究[J]. 安徽農業科學，2015，43（33）：133-136.

[26]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 食品中鉛的測定：GB/T 5009.12—2017 [S]. 北京：中國標準出版社，2017.