S100A6通過抑制細胞分裂、遷移、侵襲及促進凋亡抑制Calu-6肺癌細胞株生長

屈曉一 王婷 白樂樂西安市人民醫院(西安市第四醫院)呼吸內科 70004;西安市人民醫院(西安市第四醫院)全科 70004

目前,肺癌已成為導致癌癥相關死亡的主要原因[1]。因為早期缺乏特異性癥狀和體征,肺癌患者診斷時往往處于中晚期,失去手術機會,這是肺癌病死率居高不下的主要原因。按照病理類型,肺癌分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。其中,NSCLC可進一步分為:腺癌(38.5%)、鱗狀細胞癌(30.0%)、大細胞肺癌(2.9%)[2]。近年來,部分肺腺癌患者的預后因為針對表皮生長因子受體(epidemal growth factor receptor,EGFR)突變、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)基因重排等分子靶向藥物的廣泛使用而得以明顯改善[3]。然而,無上述突變的腺癌及鱗癌等類型因發病分子機制不明確、缺乏特異性治療靶點,至今仍無顯著進展[4]。因此,積極探索肺癌發生發展進程中參與的分子機制,進一步確定治療靶點,有望改善肺癌治療效果,延長患者生存期。

S100A6作為S100蛋白家族中重要的一員,已被證實與多種腫瘤的發生和轉移有關[5]。S100蛋白是最早由Moore等從牛腦中分離出的一種高度酸性鈣結合蛋白[6]。目前,S100家族已知擁有25個成員,其中至少16個成員基因位于1號染色體長臂2區1帶(1q21)。該區段染色體穩定性差,易發生多種染色體重排,從而導致腫瘤的發生[7-8]。在肺癌中,已證實S100A6在不同的肺癌亞型中存在差異表達。與單純支氣管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma,BAC)相比,S100A6在混合有BAC成分的肺腺癌亞型中有更高的表達。在免疫組織化學相關實驗中,與正常肺組織和局限性腫瘤組織相比,S100A6在侵襲性肺癌組織中表達更高。此外,還有研究發現S100A6在肺癌患者腫瘤細胞裂解物、血漿及胸腔積液標本中存在,高S100A6蛋白峰提示患者中位生存期較長[9]。在本研究中,我們將在細胞水平證實S100A6對肺癌細胞株生物學行為的影響,探究肺癌發生的可能分子機制。

1 資料與方法

1.1 p LVX-AcGFP1-N1-S100A6、慢病毒載體的構建及細胞感染 實驗性研究。將肺癌細胞株Calu-6(購于中國科學院)培養擴增1～2周后用pcDNA-S100A6聚合酶鏈反應(PCR)方法制備PLVX-AcGFP1-N1-S100A6。引物設計如下:正向引 物 為5′-CCCAAGCTTACCATGGCATGCCCCCTGGTCA-3′,反 向 引 物 為5′-CGGAATTCCGGTCAGCCCTTGAGGGCTTCATT-3′。然 后 應用DNA測序來驗證定位和插入序列。

p LVX-AcGFP1-N1-S100A6、pspax2和pmd2.G以2∶1∶1的比例共轉染293T細胞。72 h后在顯微鏡下觀察熒光表達,收集上清液,然后通過0.45μm PVDF過濾器(微孔)過濾,超離心(50 000 g,150 min,4℃)后獲得30倍的濃縮原料。將顆粒重新懸浮在PBS中,并在-80℃下儲存。

取對數期生長的Calu-6細胞,胰酶消化調整細胞密度為3×105/ml鋪于6孔板中,置于培養箱中培養,待細胞匯合度達到80%～90%時,加入S100A6過表達慢病毒(MOI=10),空載體對照慢病毒(MOI=10)轉染Calu-6細胞,并設置空細胞組為空白對照,命名三組為:Calu-6/S100A6實驗組(Calu-6/S100A6組)、Calu-6/空載體對照組(Calu-6/neo組)、Calu-6空細胞對照組(Calu-6組)。感 染48 h后 收 細 胞 樣 進 行QPCR、Western blot方法檢測S100A6表達情況,驗證過表達效果。

1.2 RNA提取和QPCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen,USA)進行細胞裂解,收集離心上清液,在上清液中依次加入氯仿、2-丙醇和75%乙醇,分離RNA。提取RNA后,使用Nanodrop 2000(Thermo,USA)檢測RNA的濃度和純度。使用Revert Aid First Strand cDNA合成試劑盒(Thermo,USA)完成反轉錄過程,所有步驟均按說明書嚴格執行。PCR的具體步驟和條件為:孵育(95℃、5 min)、變性(94℃、30 s共44周)、退火(55℃、30 s)、延伸(72℃、30 s)。此外,PCR中使用的引物信息如下:S100A6正向引 物(5′-GGGAGGGTGACAAGCACAC-3′)和S100A6反 向 引 物(5′-AGCTTCGAGCCAATGGTGAG-3′)；甘 油 醛-3-磷 酸 脫 氫 酶(GAPDH,內源性對照)正向引物(5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′)和GAPDH反 向 引 物(5′-GGCTGT-TGTCATACTTCTCATGG-3′)。

1.3 Western-blot 感染48 h后,收集細胞并使用總蛋白提取試劑盒進一步獲取細胞裂解物。對裂解液進行離心澄清(14 000 r/min,10 min),然后將裝載樣品緩沖液添加到裂解液中,在95℃下加熱5 min,用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離后轉移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封堵硝化纖維過濾器,然后在4℃下與S100A6的一抗(MAB769Hu22,USCN生命科學公司,中國武漢,稀釋度1/500)孵育過夜。同時,將小鼠GAPDH抗體作為內源性對照。隨后,沖洗膜,加入辣根過氧化物酶標記聚合物的二抗(LAB769Hu71,USCN生命科學公司,中國武漢,1/5 000稀釋液),再次沖洗,然后使用增強化學發光法觀察成像。

1.4 MTT增殖曲線測定 取對數期細胞Clau-6,空載體細胞,過表達載體細胞離心制成細胞懸液,細胞計數調整其濃度至(5～10)×104/ml。將細胞懸液制備好后,輕輕混勻,吸取100μl細胞懸液接種于96孔板中,每種細胞設置3個復孔,邊緣孔用無菌PBS填充。將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養,分別在培養24 h,36 h,48 h,60 h,72 h時間點取出酶標儀測定吸光度。小心吸棄上清,加入90μl新鮮培養液,再加入10μl MTT溶液,繼續培養4 h。然后吸掉上清,每孔加入100μl Formazan溶解液,置搖床上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

1.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 取對數期生長的細胞,0.25%胰酶消化并收集細胞,800 r/mim離心5 min,棄上清液,用無血清Dulbecco改良Eagle培 養 基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium,DMEM)培養液重懸細胞,計數,調整細胞密度為1×106個/ml。將3組單細胞重懸液各取100μl加入上室,下室中加入600μl含30%FBS的DMEM培養液。種板時注意下層培養基和小室中的聚碳酸酯膜間不要有氣泡產生,于37℃、5%CO2細胞培養箱內培養48 h。取出小室,小心吸去上室的培養液,PBS緩沖液輕洗3次,用消毒濕棉簽輕輕擦凈上室未遷移細胞,95%乙醇固定30 min,結晶紫染色20 min,自來水沖洗3次以上,晾干,100倍光學顯微鏡下觀察、拍照。

Transwell檢測細胞遷移和侵襲步驟類似,稍有不同的是后者所需六孔板涂有Matrigel基質膠。

1.6 流式細胞術 流式細胞術用來檢測細胞凋亡和細胞周期。取對數期細胞制成細胞懸液,細胞計數調整其濃度為3×105/ml。將細胞懸液制備好后,輕輕混勻,吸取2 000μl細胞懸液接種于6孔板中,置于培養箱培養48 h后進行流式檢測。分組處理后離心5 min(1 000 r/min,4℃),收集細胞。用預冷的PBS洗滌2次,再次離心5 min(1 000 r/min,4℃),收集細胞,調整濃度為(1～5)×105/ml。吸棄PBS,加入100μl 1×Binding Buffer重懸細胞。然后,加入5μl的Annexin VFITC和10μl的PI染色液,輕輕混勻。避光、室溫反 應10～15 min。加 入400μl 1×Binding Buffer,混勻后置于冰上,樣品在1 h內用流式細胞儀檢測。

在流式細胞檢測細胞周期檢測過程中,離心后細胞需在75%乙醇中固定1 h,用PBS洗滌,用100μl RNase A溶液處理,重新懸浮,然后在37℃的水中浸泡30 min。在400μl PI染色液存在下,將細胞沉淀在4℃的黑暗中培養30 min,然后在488 nm的波長下用流式細胞儀分析混合物。我們使用Cell Quest和Mid Fit軟件來確定細胞周期,主要包括G1、S、G2三個階段。

1.7 動物實驗 在小鼠實驗中,15只8～10周齡Balb/c裸鼠被分為Calu-6組(n=4)、Calu-neo組(n=4)和Calu-6/S100A6組(n=7)。將2.5×106/L穩定轉染的Calu-6/S100A6細胞(添加在200μl PBS中)注射到小鼠的右前背部。對照組同時注射等量的Calu-6空細胞和Calu-6/空載體細胞。每周測量每只小鼠的腫瘤體積,記錄數據。5周后,處死小鼠,取出腫瘤,然后拍照。

1.8 統計學分析 采用SPSS 22.0分析數據。計量資料以±s表達。采用單因素方差分析比較符合正態分布的3組數據差異。涉及組間、時間點雙因素的數據采用重復測量方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 S100A6 m RNA和蛋白表達情況 根據是否被S100A6過表達慢病毒載體感染,將Calu-6肺癌細胞分為3組,分別為Calu-6/S100A6實驗組,Calu-6/空載體對照組,Calu-6空細胞對照組(Calu-6組)。感染48 h后使用QPCR和Western blot方法檢測感染效果。與Calu-6/空載體對照組(Calu-6/neo組),Calu-6空細胞對照組相比,S100A6在Calu-6/S100A6實驗組(Calu/S100A6組)中高表達,蛋白(圖1A)及mRNA(圖1B)表達均呈上升趨勢,提示感染率高。

圖1 感染后S100A6在三組細胞中蛋白和m RNA表達

2.2 S100A6抑制細胞增殖、侵襲和遷移 MTT和Transwell用來檢測細胞增殖能力、侵襲和遷移能力。感染S100A6后,相比于Calu-6/neo,Calu-6,Calu-6/S100A6實驗組增殖能力下降,3組組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P＜0.01),見表1。相比于對照組,Calu-6/S100A6實驗組細胞侵襲能力和遷移能力均下降(P＜0.05),分別見圖2、圖3。

圖2 Calu-6,Calu-6/neo及Calu-6/S100A6侵襲能力 A:Calu-6；B:Calu-6/neo；C:Calu-6/S100A6；D:柱狀圖

圖3 Calu-6,Calu-6/neo及Calu-6/S100A6遷移能力 A:Calu-6；B:Calu-6/neo；C:Calu-6/S100A6；D:柱狀圖

表1 3組細胞平均吸光值比較(±s)

表1 3組細胞平均吸光值比較(±s)

組別 小鼠(n) 平均吸光值24 h 36 h 48 h 60 h 72 h Calu-6 4 0.452±0.004 0.622±0.010 0.749±0.007 0.838±0.005 0.993±0.005 Calu-6/neo 4 0.457±0.002 0.614±0.004 0.740±0.009 0.822±0.008 0.985±0.004 Calu-6/S100A6 7 0.385±0.002 0.510±0.007 0.584±0.004 0.637±0.006 0.725±0.004組間 F=1 841.990，P＜0.01時點間 F=9 734.160，P＜0.01組間·時點間 F=193.110，P＜0.01

2.3 S100A6促進Calu-6細胞凋亡、抑制細胞周期 采用流式細胞術檢測細胞凋亡能力及細胞周期變化。感染S100A6過表達慢病毒載體后,Calu-6/S100A6組 凋 亡 比 例 明 顯 升 高(P＜0.05)。Calu-6/S100A6組處于G1期的細胞比例顯著高于Calu-6對照組和Calu/neo組(P＜0.05)。與對照組比較,Calu-6/S100A6實驗組G1期到S期轉化能力下降(P＜0.05)。見表2。

表2 3組細胞凋亡能力及細胞周期變化比較(%,±s)

表2 3組細胞凋亡能力及細胞周期變化比較(%,±s)

注:與Calu-6/S100A6組比較,a P＜0.05；與Calu-6/neo組比較,b P＜0.05

組別 小鼠(n) 細胞凋亡 G1期細胞 S期細胞Calu-6 4 8.86±0.61ab 60.98±0.74ab 21.08±0.70a Calu-6/neo 4 10.01±0.07a 58.97±0.18a 21.98±1.81a Calu-6/S100A6 7 13.88±0.04 75.16±0.78 8.69±0.84 F值 401.937 967.195 238.394 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.4 S100A6抑制Calu-6細胞在小鼠體內成瘤動物實驗結果顯示:從第2周開始,Calu-6/S100A6實驗組與對照組腫瘤體積的差距逐漸擴大。3組組間、時點間以及組間時點間交互作用差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 3組動物腫瘤體積比較

3 討論

在本研究中,我們構建了S100A6表達慢病毒載體,并將其感染Calu-6細胞,進一步探討了S100A6在肺癌細胞系中的作用。通過比較三組(Calu-6、Calu-6/neo、Calu-6/S100A6)的細胞生物學行為,發現S100A6可抑制Calu-6肺癌細胞株增殖、侵襲和遷移,抑制該細胞株凋亡并抑制細胞周期中G1期向S期改變,證實S100A6可能有抑制肺癌的發生和發展的作用。

近年來,S100蛋白家族中一些成員作為多種惡性腫瘤的輔助診斷和評估預后的生物標志物越來越受到研究者的重視。這些蛋白通過結合Ca2+和激活Ca2+介導的信號通路參與許多細胞活動,如細胞增殖、分裂等[10]。S100A6作為該家族中一個重要而獨特的成員,在不同類型的腫瘤中也有不同的表達[11]。S100A6又稱為Calcylin蛋白,最初在Ehrlich腹水腫瘤細胞中發現,也是S100蛋白家族中第一個被確定與細胞增殖有關的蛋白。研究發現,與靜止細胞相比,S100A6在處于高增殖的細胞中有高表達,例如,Luu等[12]的研究發現,S100A6在骨肉瘤中表達明顯升高。Stulík等[13]研究正常結腸組織細胞、結腸腺瘤細胞和結腸癌細胞中S100A6的表達,證實S100A6在結腸癌細胞中表達升高。關于S100A6對腫瘤細胞生物學行為影響的研究則得出了矛盾的結論,即S100 A6在多種腫瘤中的升高可能會介導兩種相反的細胞生物學功能。例如,在胰腺癌中S100A6表達升高與促進細胞分化及預后差有關,m RNA和蛋白水平顯示S100A6誘導表達胰腺癌細胞內β-連環蛋白、N-黏連蛋白、波形蛋白表達增加,E黏連蛋白表達下降,而β-連環蛋白sh RNA可影響胰腺癌細胞內上皮間質轉化標志物的表達,如E-黏連蛋白表達增加,N-黏連蛋白、波形蛋白表達下降。也就是說,S100A6蛋白通過激活β-連環蛋白而促進上皮細胞-間充質轉化(epithlial-mesenchymal trans differentiation,EMT),進一步促進細胞的侵襲性,S100A6也有可能成為胰腺癌潛在的治療靶點。但在骨肉瘤中,S100A6水平增高則提示著腫瘤發生遠處轉移可能性小[14]。

在肺癌中,De Petris等[9]檢測了S100A6在A549腫瘤細胞裂解物以及39例NSCLC患者的血清和胸水中的表達情況,證實翻譯后修飾的S100A6蛋白在上述標本中均有表達。此外,研究進一步證實,S100A6陽性的病例傾向于擁有更長的生存時間,尤其那些P53表達陰性的病例[9]。相關免疫組織化學研究結果顯示:103例NSCLC組織中,25%S100A6表達陽性,且在腺癌中表達高于鱗癌(P＜0.01),S100A6表達陽性者生存期較陰性者長。上述研究與我們的研究得出的結論類似,即S100A6在肺癌細胞水平上被證實有抑癌作用。但也有一些學者得出相反的結論,He等[15]使用免疫組織化學方法檢測了177例肺鱗癌患者組織S100A6表達并根據其表達情況繪制生存曲線,發現S100A6高表達的患者生存期較短。關于其具體機制的研究發現,S100A6的廣泛生物學功能源自其可能與其他蛋白質結合并通過誘導構象變化、干擾翻譯后蛋白的方式影響其他蛋白的功能。體外實驗中發現,S100A6蛋白可以綁定到p53的N端,在其磷酸化區域較非磷酸化區域有較高的親和力。實驗進一步表明S00A6可影響抑癌基因p53作用的發揮,這可能是通過p53上至少含有6個乙酰化賴氨酸的區域—p300來實現的。Song等研究也發現,在Hep G2細胞株中,S100A6表達增高的細胞內p53的轉錄活性也增高,同時這些細胞凋亡的敏感性也更容易被過氧化氫誘發[16]。電泳遷移率變動分析顯示S100A6不影響p53與DNA結合,但另一方面,S100A6存在下p53易出現核堆積。故總的來說S100A6與p53相互作用并影響其生物活性[16]。

本研究證實S100A6可從多方面抑制Calu-6肺癌細胞株生長。但結合目前其他學者的研究結論,S100A6在肺癌中可能扮演較復雜角色,其發揮作用具體的機制也需要進一步研究,在未來的實驗中也希望將在多種肺癌細胞株及多層面探究S100A6在肺癌中所發揮的具體作用及具體分子機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突