3-乙酸齊墩果酸對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制研究

齊阿寅 賴永新 紀(jì)春東

遼健集團(tuán)阜新礦總醫(yī)院呼吸內(nèi)科 123000

肺癌為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤疾病[1],且呈現(xiàn)逐年上升和低齡化的趨勢[2],非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)為其中的主要亞型,占肺癌總例數(shù)的80%～90%[3]。目前,手術(shù)結(jié)合放化療仍為其主要治療手段[4],然而,由于腫瘤細(xì)胞的耐藥以及放化療較大的不良反應(yīng),導(dǎo)致多數(shù)患者預(yù)后較差、生存質(zhì)量欠佳,因此尋求療效好、不良反應(yīng)低的替代治療藥物成為目前亟待解決的難題[5]。近年來,天然提取物憑借其高效低毒的特點(diǎn),已逐步成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。齊墩果酸(oleanolic acid,OA)為人參中的次要活性成分之一,是一種五環(huán)三萜類天然化合物,國內(nèi)外已有研究[6-7]表明其具有良好的抗炎、抗氧化、保肝、降血糖和抗腫瘤等多種活性。c-Jun氨 基 末 端 激 酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路亦稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)通路,是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的重要分支之一,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及應(yīng)激等多種生理病理過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。因此,本研究以O(shè)A為基礎(chǔ)合成了其乙酸化衍生物——3-乙酸齊墩果酸(oleanolic acid 3-acetate,OA3A),觀察其對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并探究其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA):美國Gibco公司；二甲亞砜(DMSO)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、RIPA裂解液、MTT:北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸化活化形式(p-JNK)、JNK抗體:美國Abcam公司；Bax、裂解半胱天冬酶3(cleaved-Caspase 3)、Bcl-2、β-actin兔多克隆抗體:美國Santa Cruz公司。實驗性研究。

1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀,德國Partec公司；透射電子顯微鏡:日本Olympus公司；超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱:Thermo Fisher Scientific；超低溫冰箱:美國Thermo Scientific公司；離心機(jī):美國Sigma公司；酶標(biāo)儀:美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞 由遼健集團(tuán)阜新礦總醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心實驗室細(xì)胞庫提供,將復(fù)蘇的A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS+1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天更換1次培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁生長至融合85%左右時,以0.02% EDTA+0.25%胰蛋白酶消化傳代,分瓶培養(yǎng)或進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 藥物配制及分組 稱取適量OA3A粉末溶于DMSO中,配制成濃度為10 mg/ml的母液,再以完全培養(yǎng)基稀釋成高(40 mg/L)、中(20 mg/L)、低(10 mg/L)濃度的工作液,實驗共分 為 對 照 組、0.5% DMSO組、10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L OA3A組。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞生存率 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞,以完全培養(yǎng)基制備成密度為1×104個/ml的細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,每孔各100μl,每組各設(shè)置6個復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁生長24 h后,分別按上述分組各加入100μl工作液,繼續(xù)孵育24 h,吸棄上清,加入5 mg/ml的MTT溶 液20μl,孵 育4 h后 吸 棄 上 清,以100μl DMSO溶解結(jié)晶,震蕩10 min,于490 nm下檢測各孔的吸光度值(OD)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將A549細(xì)胞以1×106個/ml的密度接種于6孔板中,每孔100μl,貼壁生長24 h后,按上述分組各加入100μl工作液,繼續(xù)孵育24 h,以不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,PBS洗滌兩次并重懸細(xì)胞,取100μl單細(xì)胞懸液,加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI,震蕩混合均勻,于室溫下避光孵育15 min,使用流式細(xì)胞儀分別在525 nm(Annexin V-FITC)和610 nm(PI)波長下檢測熒光強(qiáng)度。

1.3.5 Western Blot檢測 JNK通路活性和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)按前述方法對各組細(xì)胞進(jìn)行給藥處理,培養(yǎng)24 h后用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白上樣,12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉1 h,于4℃下加入一抗p-JNK(1∶1 000)、JNK(1∶1 500)和β-actin(1∶2 000)孵育過夜,PBS洗滌3次,加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)后繼續(xù)孵育1 h,PBS洗膜,加入ECL顯影后于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光,應(yīng)用Image Lab軟件對圖像進(jìn)行分析并測定灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩相比采用SNK-q檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率 各組A549細(xì)胞存活率情況:10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L OA3A組的細(xì)胞存活率均顯著低于對照組(P＜0.05)；3組OA3A組之間兩兩相比,細(xì)胞存活率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),隨著OA3A濃度的增加,細(xì)胞存活率逐漸降低。見表1,圖1。

圖1 各組細(xì)胞存活率比較(n=6)

2.2 細(xì)胞凋亡率 與對照組比較,10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L OA3A組的細(xì)胞凋亡率均較高(P＜0.05)；3組OA3A組之間兩兩相比,細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),隨著OA3A濃度的增加,細(xì)胞凋亡率逐漸升高,見表1,圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率比較(n=6)

2.3 JNK通路活性 與對照組比較,10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L OA3A組的p-JNK的相 對 表達(dá)均較高(P＜0.05)；且隨著OA3A濃度的增加,p-JNK的相對表達(dá)逐漸升高(P＜0.05)；而各組之間JNK的相對表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表1,圖3。

圖3 p-JNK和JNK的相對表達(dá)(n=6) A:各組p-JNK、JNK蛋白電泳圖；B:各組p-JNK蛋白表達(dá)；C:各組JNK蛋白表達(dá)

表1 各組細(xì)胞存活率細(xì)胞凋亡率和JNK通路活性比較(±s)

表1 各組細(xì)胞存活率細(xì)胞凋亡率和JNK通路活性比較(±s)

注:與對照組比較,a P＜0.05；與0.5% DMSO組比較,b P＜0.05；與OA3A 10 mg/L組比較,c P＜0.05；與OA3A 20 mg/L組比較,d P＜0.05

組別 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞存活率 細(xì)胞凋亡 p-JNK相對表達(dá) JNK相對表達(dá)對照組 6 100.05±2.12 3.41±0.82 0.49±0.21 2.14±0.61 0.5%DMSO組 6 101.09±3.45 3.21±0.95 0.51±0.17a 2.17±0.57 OA3A10 mg/L組 6 91.20±2.04ab 15.89±4.61ab 1.13±0.12ab 2.08±0.59 OA3A20 mg/L組 6 81.38±5.67abc 37.16±5.48abc 2.23±0.20abc 2.09±0.51 OA3A40 mg/L組 6 75.11±7.48abcd 51.23±7.23abcd 3.89±0.18abcd 2.15±0.63 F值 35.973 129.842 388.123 0.027 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.998

2.4 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 與對照組比較,OA3A組中促凋亡相關(guān)蛋白Bax和c-Caspase 3的相對表達(dá)均顯著上升(P＜0.05),而抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的相對表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)；隨著OA3A濃度的增加,Bax和c-Caspase 3的相對表達(dá)亦相應(yīng)升高(P＜0.05),而Bcl-2的相對表達(dá)相應(yīng)降低(P＜0.05),見表2和圖4。

圖4 凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)(n=6) A:各組Bax、c-Caspase和Bcl-2蛋白電泳圖；B:各組Bax、c-Caspase和Bcl-2蛋白表達(dá)柱狀圖

表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)比較(±s)

表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)比較(±s)

注:與對照組比較,a P＜0.05；與0.5% DMSO組比較,b P＜0.05；與OA3A 10 mg/L組比較,c P＜0.05；與OA3A 20 mg/L組比較,d P＜0.05

組別 細(xì)胞數(shù) Bax c-Caspase-3 Bcl-2對照組 6 0.59±0.29 0.23±0.19 0.98±0.26 0.5%DMSO組 6 0.57±0.27 0.22±0.17 0.99±0.23 OA3A10mg/L組 6 0.89±0.15a 0.46±0.30ab 0.62±0.17ab OA3A20mg/L組 6 1.37±0.14abc 0.88±0.25abc 0.33±0.11abc OA3A40mg/L組 6 1.94±0.27abcd 1.41±0.31abcd 0.12±0.09abcd F值 37.491 24.571 26.528 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

目前臨床對于NSCLC的治療方案主要以手術(shù)切除、放療、化療以及免疫治療相結(jié)合為主[9],盡管外科手術(shù)方式、放療技術(shù)以及靶向藥物不斷推陳出新,但肺癌患者預(yù)后及轉(zhuǎn)歸仍不理想[10]。臨床常用治療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時,也殺傷了體內(nèi)正常細(xì)胞,帶來了巨大的不良反應(yīng),制約了其進(jìn)一步的治療[11]。

OA是廣泛存在于齊墩果、青葉膽、女貞子、人參等植物中的天然五環(huán)三萜化合物,具有抗炎、保肝降酶、強(qiáng)心利尿、降血糖、調(diào)節(jié)血脂和抗腫瘤等多種活性[12],Li等[13]報道稱,OA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程而抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖；Zhao等[14]的研究則表明,OA可通過miR-122/Cyclin G1/MEF2D信號通路誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞周期的阻滯,而實現(xiàn)抗腫瘤活性。然而,OA較差的水溶性限制了其應(yīng)用的進(jìn)一步拓展,因此本研究基于OA的分子結(jié)構(gòu)合成了一種新的衍生物——OA3A,通過MTT實驗和流式細(xì)胞術(shù),觀察其對A549細(xì)胞的影響。實驗結(jié)果顯示,OA3A抑制了A549細(xì)胞的增殖,促進(jìn)了其凋亡,且這種作用呈劑量依賴性。Jo等[15]最新的研究表明,OA3A可通過不依賴活性氧(reactive oxygen species,ROS)的線粒體途徑,誘導(dǎo)卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡,OA3A可作為一種潛在的抗腫瘤輔助用藥。

為進(jìn)一步探究OA3A抑制A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的分子機(jī)制,筆者采用Western blot檢測了JNK通路的活性,結(jié)果顯示,OA3A可促進(jìn)JNK的磷酸化,而活化的JNK通路可借助于轉(zhuǎn)錄依賴的方式調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果顯示,JNK下游促凋亡靶基因Bax和c-Caspase 3的表達(dá)顯著上調(diào),而抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2則顯著下調(diào),提示JNK通路參與了OA3A誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的過程。Bax為人體中最主要的促凋亡基因之一,廣泛分布于血管、支氣管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞中,可通過促進(jìn)細(xì)胞色素C(cytochrome c,cyt-C)自線粒體向胞質(zhì)釋放而激活Caspase 9,進(jìn)而激活其下游凋亡關(guān)鍵基因Caspase 3,從而啟動凋亡程序[16]。Bcl-2為公認(rèn)的抗凋亡基因,主要分布于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體膜上,可通過改變線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)、調(diào)節(jié)線粒體膜對凋亡基因前體的通透性等途徑阻止自由基、射線以及各種化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[17]。促凋亡和抗凋亡基因之間的維持動態(tài)平衡,共同調(diào)節(jié)凋亡的誘發(fā)和進(jìn)展。夏榮木等[18]的研究報道稱,OA可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)促凋亡相關(guān)因子Bax、tBid、c-Caspase 3的表達(dá)、抑制抗凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)有關(guān)。鐘方明等[19]的研究顯示,隨著食管癌KYSE150和EC109細(xì)胞凋亡率的增加,Bax、Bak和c-Caspase 9的表達(dá)顯著增加,而Bcl-2的表達(dá)顯著降低,提示JNK通路可能參與了食管癌細(xì)胞的凋亡過程。

綜上,本研究顯示,OA3A可抑制A549細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,可作為一種潛在的抗NSCLC的藥物,其作用機(jī)制可能是通過JNK通路實現(xiàn)的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突