基于生物信息學(xué)研究CXCL13在非小細(xì)胞肺癌中的作用

陳富剛 馬南 何志義

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,南寧 530021

85%左右的肺癌患者病理類型為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1],NSCLC主要分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鱗癌(lung squamous carcinoma,LUSC)[2]。隨著近幾年來靶向治療及免疫治療在NSCLC中的開展,對(duì)部分患者的疾病緩解起到了顯著延長(zhǎng)的作用,但是尋求更有效的治療方法以及如何解決免疫細(xì)胞腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)仍然是目前研究的一個(gè)重點(diǎn)。

CXC類趨化因子及其受體已被發(fā)現(xiàn)在血管生成,腫瘤細(xì)胞的侵襲,轉(zhuǎn)移和遷移過程中有著非常的重要作用[3]。CXCL13又稱為B淋巴細(xì)胞趨化因子,與炎癥、免疫密切相關(guān),CXCL13最初被稱為B淋巴細(xì)胞趨化因子(B lymphocyte chemoattractant,BLC)或BCA-1,是一種穩(wěn)態(tài)趨化因子。它由次級(jí)淋巴組織(濾泡)B細(xì)胞區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞組成性分泌,如脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體[4-5]。CXCL13主要分布在胃、肝臟和淋巴結(jié)中,在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng),并參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[6]。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)在已成為研究腫瘤的熱點(diǎn),對(duì)它的類別和功能的研究將會(huì)加深對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的了解。腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要價(jià)值,在判斷預(yù)后方面也具有指導(dǎo)意義,對(duì)腫瘤相關(guān)組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝產(chǎn)生影響,腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響效果[7]。除了腫瘤細(xì)胞外,腫瘤微環(huán)境還包括眾多免疫細(xì)胞,如B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TILs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumorassociated macrophages,TAMs)等[8]。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)作為一種新興的測(cè)序技術(shù)得到了快速成長(zhǎng),并且已經(jīng)成為了一項(xiàng)成熟技術(shù),已在表觀遺傳、基因、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄等多個(gè)組學(xué)水平完成測(cè)序,可在單個(gè)細(xì)胞的不同組學(xué)水平上對(duì)惡性腫瘤異質(zhì)性、腫瘤演變以及臨床診治等多個(gè)方面進(jìn)行深入地研究[9]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成內(nèi)容,在腫瘤細(xì)胞中DNA整體呈低甲基化狀態(tài)而某些特定區(qū)域如啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)[10-11]。DNA甲基化因?yàn)樗姆€(wěn)定性和容易檢測(cè),已經(jīng)被證實(shí)有顯著的臨床實(shí)用價(jià)值[12]。

Wang等[13]的研究證實(shí)了CXCL13在NSCLC患者血清中、肺組織中升高,提示CXCL13參與NSCLC疾病進(jìn)展,但是CXCL13在NSCLC中與免疫浸潤(rùn)、癌細(xì)胞功能等機(jī)制的研究目前較少。本研究擬聯(lián)合使用免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、單細(xì)胞測(cè)序及甲基化相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù),研究CXCL13在NSCLC中的作用,特別是CXCL13與NSCLC中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系,為進(jìn)一步深入研究CXCL13在NSCLC中的作用提供幫助。

1 資料與方法

1.1 差異基因查找 使用Gepia數(shù)據(jù)庫(kù)查找NSCLC正常組織與癌組織差異基因,分析數(shù)據(jù)來源于2020年7月1日 前Gepia數(shù) 據(jù) 庫(kù) 收 錄 的TCGA數(shù)據(jù),在高表達(dá)差異基因中篩選出與炎癥相關(guān)的CXCL13。分析方法選用LIMMA算法。LUAD組中,癌癥483例,對(duì)照347例。LUSC組中,癌癥486例,對(duì)照338例。篩選標(biāo)準(zhǔn):log2FC＞1且P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 驗(yàn)證CXCL13蛋白在NSCLC患者中的表達(dá) 使用Proteinatlas數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫組織化學(xué)結(jié)果,分析CXCL13在NSCLC患者癌組織以及正常肺組織中蛋白表達(dá)情況。

1.3 CXCL13與NSCLC腫瘤功能相關(guān)性 使用CancerSEA網(wǎng)站分析CXCL13在不同NSCLC單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中與癌癥各種功能狀態(tài)之間的相關(guān)性,使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析。

1.4 CXCL13在NSCLC中甲基化情況 使用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)分析CXCL13在NSCLC中甲基化水平,以及CXCL13甲基化水平與NSCLC患者吸煙、分期、TP53突變、臨床分期、淋巴結(jié)受累之間的關(guān)系。

1.5 CXCL13與NSCLC中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中使用反卷積算法得到的LUSC和LUAD中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組成,分析CXCL13表達(dá)與NSCLC中B細(xì)胞、T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性,并同時(shí)使用多因素分析研究CXCL13表達(dá)、B細(xì)胞、T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞免疫浸潤(rùn)與NSCLC預(yù)后的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13在NSCLC中m RNA表 達(dá)CXCL13在NSCLC中m RNA的表達(dá)在癌組織中明顯高于正常組織(P＜0.05),見圖1。

圖1 CXCL13在NSCLC中mRNA表達(dá)情況(a P＜0.05)

2.2 CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達(dá)情況Proteinatlas數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達(dá)情況。CXCL13在NSCLC肺組織中表達(dá)稍高于正常肺組織,見圖2。

圖2 CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達(dá)情況 A、D:正常肺組織；B、C:LUAD；E、F:LUSC

2.3 CXCL13與NSCLC腫 瘤 功 能 相 關(guān) 性CancerSEA分析CXCL13在不同NSCLC單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中各種功能狀態(tài)活動(dòng)之間的相關(guān)性(圖3)。

圖3 CXCL13與NSCLC腫瘤功能相關(guān)性 A:Kim(EXP0068)提示CXCL13與細(xì)胞周期、侵襲、DNA損傷和修復(fù)等相關(guān)。B:詳細(xì)功能關(guān)聯(lián)提示CXCL13表達(dá)在NSCLC患者中與轉(zhuǎn)移和侵襲呈正相關(guān)(Spearman系數(shù)分別為0.34、0.31,P＜0.001),與DNA修復(fù)呈負(fù)相關(guān)(Spearman系數(shù)為-0.34,P＜0.001)

2.4 CXCL13在NSCLC中甲基化情況 Ualcan分析CXCL13在NSCLC中甲基化水平,在LUSC患者癌組織、吸煙者組織以及無論是否存在P53突變、患者處于不同的臨床分期、不同淋巴結(jié)受累程度的情況下,多觀察到CXCL13甲基化水平降低(圖4),而在LUAD患者中結(jié)果多為相反(P＜0.05)(圖5)。

圖4 不同LUSC患者中CXCL13甲基化水平 A:腫瘤早期；B:腫瘤不同時(shí)期；C腫瘤轉(zhuǎn)移；D:P53突變；E:吸煙情況

圖5 不同LUAD患者中CXCL13甲基化水平 A:腫瘤早期；B:腫瘤不同時(shí)期；C腫瘤轉(zhuǎn)移；D:P53突變；E:吸煙情況

2.5 CXCL13表達(dá)在NSCLC中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系 利用TIMER網(wǎng)站分析CXCL13在NSCLC中免疫浸潤(rùn)水平。CXCL13的表達(dá)在NSCLC患者中腫瘤純度呈負(fù)相關(guān),與NSCLC患者B細(xì)胞、T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)(P＜0.05),但相關(guān)程度比較低(Rho＜0.7,圖6～9)。經(jīng)多因素Cox回歸分析,CXCL13高表達(dá)合并高水平T細(xì)胞CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)組LUSC患者預(yù)后好于CXCL13高表達(dá)合并低水平T細(xì)胞CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)組(P＜0.05),CXCL13高表達(dá)合并低水平Tregs細(xì)胞浸潤(rùn)組LUSC患者預(yù)后好于CXCL13高表達(dá)合并高水平Tregs細(xì)胞浸潤(rùn)組(P＜0.05)。其余分組預(yù)后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖10)。

圖6 LUSC患者T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞、B細(xì)胞浸潤(rùn)程度與預(yù)后關(guān)系

圖7 LUAD患者T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞、B細(xì)胞浸潤(rùn)程度與預(yù)后關(guān)系

圖8 LUSC患者T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞、B細(xì)胞浸潤(rùn)程度與預(yù)后關(guān)系

圖9 LUAD患者T細(xì)胞CD8+細(xì)胞、Tregs細(xì)胞、B細(xì)胞浸潤(rùn)程度與預(yù)后關(guān)系

圖10 CXCL13的表達(dá)與NSCLC患者Tregs細(xì)胞免疫浸潤(rùn)水平與預(yù)后的關(guān)系,使用QUANTISEQ算法分析 A:肺腺癌；B:肺鱗癌

3 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)刺激的一種防御反應(yīng),也是腫瘤的標(biāo)志之一,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用,而趨化因子是腫瘤中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的最重要的介質(zhì)分子[14]。趨化因子不僅可誘發(fā)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤細(xì)胞,而且還可促進(jìn)新生腫瘤細(xì)胞存活、侵犯及增殖[15]。

CXCL13是一種炎癥趨化因子,本研究通過Gepia篩選NSCLC中存在差異表達(dá)的基因,CXCL13m RNA在NSCLC癌組織中表達(dá)明顯高于正常組織,進(jìn)一步使用Proteinatlas數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示在CXCL13蛋白表達(dá)在NSCLC肺組織中高于正常肺組織。

T濾泡輔助細(xì)胞(TFH cell)的浸潤(rùn)并產(chǎn)生的CXCL13對(duì)腫瘤部位產(chǎn)生B細(xì)胞反應(yīng)非常重要,并與促進(jìn)局部記憶B細(xì)胞分化以及T調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群的擴(kuò)張有關(guān)[16]。在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)細(xì)胞的微環(huán)境調(diào)節(jié)中CXCL13/CXCR5軸具有特別重要的作用,B-CLL即外周血、次級(jí)淋巴組織和骨髓中CD5+腫瘤性B細(xì)胞的單克隆群體,次級(jí)淋巴器官和骨髓是B-CLL細(xì)胞增殖的庇護(hù)所,也保護(hù)它們免受自發(fā)或藥物誘導(dǎo)的凋亡。CXCL13/CXCR5信號(hào)有助于B-CLL細(xì)胞進(jìn)入這些庇護(hù)所[17]。本研究結(jié)果顯示CXCL13與NSCLC中B細(xì)胞浸潤(rùn)存在明顯相關(guān)性,且B細(xì)胞浸潤(rùn)與不良預(yù)后明顯相關(guān)。CD8+T細(xì)胞密度被認(rèn)為是一個(gè)強(qiáng)效的生存預(yù)測(cè)指標(biāo),CD8+T細(xì)胞密度也被認(rèn)為與免疫治療的療效密切相關(guān)[18]。在癌癥晚期、化療后的患者中均顯示CD8+T細(xì)胞密度與預(yù)后密切相關(guān)[19-20],而腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)程度增高與良好預(yù)后相關(guān)。Tregs和Treg釋放的免疫抑制因子進(jìn)入腫瘤的微環(huán)境是重建抗腫瘤免疫反應(yīng)的一種途徑[21]。NSCLC患者腫瘤組織、骨髓、淋巴結(jié)或外周血中高密度的異源性Treg被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[22]。本研究結(jié)果顯示CXCL13在NSCLC中CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(P＜0.05),但與Treg細(xì)胞相關(guān)系數(shù)較低。提示CXCL13的表達(dá)增高與NSCLC中CD8+T浸潤(rùn)密切相關(guān),與Treg細(xì)胞浸潤(rùn)亦存在相關(guān)性,但仍需要進(jìn)一步深入研究。

CancerSEA是分析單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù),使用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析CXCL13在NSCLC各種細(xì)胞群及其功能的相關(guān)性,結(jié)果提示CXCL13表達(dá)在NSCLC細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移、血管生呈正相關(guān),與DNA修復(fù)呈負(fù)相關(guān)。之前的研究已經(jīng)顯示CXCL13在肺癌組織明顯高表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移[13,23]。在NSCLC患者中CXCL13/CXCL5參與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,體外實(shí)驗(yàn)顯示CXCL 13刺激可以顯著促進(jìn)NSCLC來 源 的NCI-H1915細(xì) 胞 遷 移[23]。CXCL13在肺癌小鼠模型中通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放SPP1,從而促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[13]。CXCR1、CXCR2和CXCR4及其配體CXCL5、CXCL8和CXCL12的高表達(dá)似乎與腫瘤血管生成有關(guān)[23],但是,CXCL13與腫瘤中血管生成、DNA修復(fù)的具體機(jī)制目前仍缺乏具體研究。

DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)有關(guān),有可能在癌癥早期就發(fā)生[24],DNA甲基化狀態(tài)的改變也被作為癌癥初期診斷和治療的標(biāo)記物與藥物靶點(diǎn)之一。癌癥細(xì)胞中DNA序列改變可伴隨啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài),但全基因組的狀態(tài)處于低甲基化[10-11]。高甲基化狀態(tài)主要通過抑制正?；虻谋磉_(dá)進(jìn)而誘發(fā)癌癥[25]。而低甲基化狀態(tài)一般表現(xiàn)在重復(fù)序列上,降低染色體的穩(wěn)定性,也會(huì)啟動(dòng)部分原癌基因來加快腫瘤發(fā)生[26-27]。CXCL13在LUSC中的啟動(dòng)子甲基化與正常組織相比多處于低甲基化狀態(tài),無論從分期、是否有TP53基因突變或者是否吸煙,而在LUAD中則多處于高甲基化狀態(tài),趨化因子和受體上調(diào)是由不同的機(jī)制驅(qū)動(dòng)的,包括CXCL13基因的Rel A和Nrf2的轉(zhuǎn)錄控制,以及CXCR5啟動(dòng)子的表觀遺傳調(diào)控(缺乏Cp G島甲基化)[28]。CXCL13在LUSC、LUAD中的甲基化水平不同,具體機(jī)制及臨床應(yīng)用需要待進(jìn)一步深入研究。

本研究基于生物信息學(xué),通過使用TIMER、CancerSEA、Gepia等數(shù)據(jù)庫(kù)來進(jìn)行分析研究CXCL13在NSCLC中的功能。但是,本研究仍有一些不足之處,首先很多趨化因子與腫瘤免疫浸潤(rùn)有著聯(lián)系,比如CXCL8、CXCL12、CXCL21等,但是我們未能全面而系統(tǒng)地研究趨化因子家族在NSCLC中的功能,其次腫瘤免疫浸潤(rùn)參與的細(xì)胞包括有很多種,如CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等,本研究只分析了其中三種。

總之,通過生物信息學(xué)方法,我們分析了CXCL13在NSCLC中的作用,CXCL13的高表達(dá)與NSCLC中B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和Tregs細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)相關(guān),但與Tregs細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)相關(guān)性較低。CXCL13與NSCLC的轉(zhuǎn)移與侵襲有關(guān),并且通過啟動(dòng)子甲基化的參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其在LUSC和LUAD的 作 用 不 同。CXCL13參 與NSCLC的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及腫瘤細(xì)胞功能,因此通過靶向免疫抑制CXCL13,也許可以作為今后對(duì)NSCLC的免疫治療方法之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突