超聲波-雙水相提取青果黃酮及其抗氧化性研究

熊庭雨，侯小勤，阮尚全，2*

(1.內江師范學院 化學化工學院，四川 內江 641199；2.四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室，四川 內江 641199)

0 引言

【研究意義】青果果實富含黃酮類、多酚類、三萜類、揮發性芳香物、蛋白質、氨基酸等多種物質，兼有食用和藥用價值[1-2]，其中黃酮化合物具有抗氧化性、抗皺抗衰、抗炎、抗病毒、鎮痛、降血壓等功效，在食品加工、生物制藥等方面都有極其重要的作用[3-5]。四川合江青果已有1 000余年的種植歷史，主要為橄欖科橄欖屬白欖種，常年產量超過600萬kg，占四川青果產量的95%以上，具有一定的藥用價值。開展青果黃酮提取方式的研究，對擴大青果活性物質在食品加工、生物制藥等方面的開發利用具有現實意義。【前人研究進展】黃酮化合物提取技術主要有傳統溶劑提取法、超聲波輔助法、真空氣流細胞破壁法、酶法、溶劑氣浮分離技術、微波輔助萃取法、水熱法提取等[6-13]。國內對青果總黃酮的提取方式主要是采用傳統水提法、溶劑提取法、酶法、真空氣流細胞破壁法等，而傳統水提法提取率比較低，成本較高，且部分是有毒有害溶劑；酶法提取雖然提取率較高，但酶易失去活性，微波時間雖較短，但易破壞分子結構，產生對人體有害的物質[14]。【研究切入點】目前，鮮見超聲波-雙水相法提取合江青果黃酮的研究報道。【擬解決的關鍵問題】采用超聲波-雙水相技術提取合江青果的黃酮[15]，發揮其超聲波的機械振動、空化作用以及硫酸銨作用條件較溫和、分相時間短、易分相、有機溶劑殘留少、選擇性較好等優點，利用響應曲面優化建立提取黃酮的試驗模型，并對提取物進行定性鑒定和抗氧化性試驗，以期為合江青果的開發利用提供理論依據和新的試驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 青果 青果采自四川合江某青果生產基地，取果肉于50℃干燥箱中烘干，粉碎后過50目篩，裝袋密封備用。

1.1.2 試劑 蘆丁、無水乙醇、氫氧化鈉、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、二苯代苦味酰基苯肼等試劑，均為分析純，成都科龍化工試劑廠；RO膜過濾水，等。

1.1.3 儀器 BSA224S電子天平(賽多利斯上海公司)，電熱鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，超聲波清洗儀(江蘇昆山)，TDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)，T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 繪制標準曲線 將20.0 mg蘆丁配制成濃度為400 μg/mL的溶液，分別吸取0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和6.00 mL置于25 mL比色管中，參照文獻[16]的方法處理并測定吸光度，得到吸光度(A)與濃度(C)的一元線性回歸方程：

A=0.012 28C+0.042 68(R2=0.999 9)

1.2.2 分相鹽的篩選 精確稱取2份青果粉各1.000 g，各加入60%乙醇溶液30 mL，然后分別加入7 g硫酸銨或5 g磷酸氫二鉀，混勻靜置10 min，在超聲波功率為280 W、溫度為60 ℃下提取60 min，在轉速為4 000 r/min下趁熱離心分離10 min，用30%乙醇將離心液定容于50 mL容量瓶中，精確量取0.50 mL于比色管中，參照1.2.1步驟進行顯色測定，計算青果黃酮提取率，比較2種分相鹽的提取效果。

1.2.3 黃酮的提取及測定 精確稱取1.000 g 青果粉放入50 mL提取瓶，加一定體積和濃度的乙醇，再加入分相鹽混勻，靜置10 min，按照一定功率、溫度下超聲提取一定時間，然后4 000 r/min轉速下趁熱分離10 min，取上層提取液用30%乙醇定容于50 mL容量瓶中，精確量取0.50 mL于比色管中，參照1.2.1步驟測定吸光度，計算黃酮提取率的流程進行單因素提取試驗，分別考察乙醇濃度、液料比(mL∶g)、硫酸銨用量、提取時間、超聲波功率和提取溫度等因素對黃酮提取率的影響。其中，以7 g/30mL硫酸銨、60%乙醇溶液、超聲波功率280 W、溫度60℃、時間60 min和液料比30∶1為固定水平，根據各測定指標的變化試驗條件相應因素作變換后進行提取。

1) 乙醇濃度。設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%和90%。

2) 液料比(mL∶g)。分別設定為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1。

3) 硫酸銨用量。分別設定為4 g/30mL、5 g/30mL、6 g/30mL、7 g/30mL、8 g/30mL和9 g/30mL。

4) 提取時間。分別設定為20 min、40 min、60 min、80 min和100 min。

5) 超聲波功率。分別設定為200 W、240 W、280 W、320 W和360 W。

6) 提取溫度。分別設定為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃。

1.2.4 響應曲面設計優化提取工藝 以硫酸銨用量(A)/(g/30mL)、超聲波功率(B)/W、提取時間(C)/min為設計因素，其他條件為單因素試驗最佳條件，黃酮提取率(Y)為響應值，采用Box-Benhnken進行優化設計(表1)。

表1 青果黃酮提取率的響應曲面設計因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface design

1.2.5 驗證試驗 選擇各因素最優水平，在便于操作的試驗條件下，按照1.2.3的步驟進行5次平行驗證試驗，試驗結果與理論模型值比較，檢查試驗模型的指導意義。

1.2.6 黃酮化合物的理化性質測定

1) 定性鑒定試驗。取黃酮提取液2 mL于試管中，參照文獻[17]的方法，分別滴加4%NaOH、10%Al(NO3)3、25%氨水溶液和飽和碳酸鈉溶液，觀察溶液顏色變化，初步鑒定黃酮類化合物的結構類型。

2) 清除DPPH·試驗。分別取0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.60 mg/L、0.80 mg/L、1.00 mg/L、1.20 mg/L和1.40 mg/L黃酮提取溶液于比色管中，加入濃度為20 mmol/L的DPPH溶液，用95%的乙醇定容至4 mL，搖勻，避光靜置30 min。參照文獻[18]方法測提取液吸光度(Ai)，用相同方法以等體積95%乙醇溶液替代DPPH測定不加PDDH提取液的吸光度(Aj)，用等體積超純水替代黃酮溶液測定空白對照吸光度(Ac)，考查提取液清除DPPH·的能力[19]。同時，用等濃度的蘆丁、VC溶液進行比較試驗，考查其清除能力的強弱。

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%

1.3 統計分析

用Origin 7.5對試驗數據作圖，用Design-Expert 8.05進行相應曲面分析。

2 結果與分析

2.1 不同分相鹽處理青果黃酮的提取率

經測定，以硫酸銨和磷酸二氫鉀作分相鹽時黃酮的提取率分別為2.88%和1.63%，硫酸銨較磷酸二氫鉀作分相鹽時的黃酮提取率高76.69%。此時試驗廢渣中硫酸銨與磷酸氫二鉀均有剩余，表明，2種鹽溶解已達到飽和狀態。觀察發現，試驗中硫酸銨分相好，而磷酸氫二鉀分相界面不清晰；同時，硫酸銨價格相對磷酸氫二鉀便宜，環境污染小，因此，后續試驗選取硫酸銨作為分相鹽。

2.2 不同提取因素處理青果黃酮的提取率

從圖1看出，不同提取因素對青果黃酮提取率的影響存在差異。

圖1 不同提取因素處理青果黃酮的提取率

2.2.1 乙醇體積分數 隨乙醇體積分數增加，黃酮提取率呈先升后降趨勢；各處理青果黃酮的提取率為2.51%～3.13%，其中，乙醇體積分數為70%時黃酮提取率為最大值，60%時其次，50%時最低，依次為70%>60%>80%>90%>50%。乙醇體積分數為70%時黃酮提取率最大，其原因可能是：黃酮類化合物與乙醇均具有一定極性，根據相似相溶原理，70%的醇水體系能更好地相溶；同時乙醇濃度增大也增大其他脂溶性成分的溶解能力，當超過70%時，可能減小青果黃酮的溶解優勢，致使其提取效果下降[20]。因此，乙醇體積分數以70%為最佳，后續試驗乙醇體積分數為70%。

2.2.2 硫酸銨用量 黃酮提取率隨硫酸銨用量增多呈先增后降趨勢；各處理青果黃酮的提取率為3.16%～3.44%，其中，當硫酸銨用量達6 g/30mL時，黃酮提取率為最大值，7 g/30mL時其次，9 g/30mL時最低；依次為6 g/30mL>7 g/30mL>5 g/30mL>4 g/30mL>8 g/30mL>9 g/30mL。硫酸銨用量達6 g/30mL時黃酮提取率最大，其原因可能是：體系中硫酸銨與乙醇奪取水分子，因此當硫酸銨用量增多時，水分子從乙醇相中逐漸脫離，改變體系的極性，使得黃酮分子在醇層富集，提取率逐漸升高，但水分子分離時，可能導致一部分黃酮類化合物隨之流失，不利于黃酮的提取[21]。由于硫酸銨用量在6 g/30mL時分相界面清晰且溶解達到飽和，因此硫酸銨最佳用量為6 g/30mL。后續試驗硫酸銨用量為5 g/30mL、6 g/30mL和7 g/30mL。

2.2.3 液料比 隨著液料比增加青果黃酮提取率呈先升后降趨勢；各處理青果黃酮提取率為2.83%～3.16%，其中，液料比為35∶1時黃酮提取率最大，30∶1時其次，20∶1時最低；依次為35∶1>30∶1>40∶1>25∶1>20∶1。液料比為35∶1時黃酮提取率最大，其原因可能是：當提取液增多時，青果粉末與溶液接觸面積增大，使反應更加容易，促進黃酮的提取。當液料比超過35 ∶1時，因硫酸銨溶解量不同而影響體系的分相結果，并且提取液增加可能使其他成分溶出，從而導致黃酮提取率下降。因此，液料比以35∶1最佳，后續試驗液料比為35∶1。

2.2.4 超聲波功率 隨著超聲波功率增加黃酮提取率呈先降后升再降趨勢；各處理青果黃酮提取率為2.96%～3.34%，其中，超聲波功率為280 W時黃酮提取率最大，240 W時其次，200 W時最低；依次為280 W>240 W>320 W>360 W>200 W。在超聲波功率為280 W時提取率最大，其原因可能是：功率加大能量越高，利于解除其他成分對黃酮分子的羈絆，同時也使得黃酮分子越活潑，運動加快，提高提取率[22]；但功率過高一定程度上也破壞黃酮類化合物的結構，致使黃酮的提取效果下降。因此，超聲波功率最佳為280 W，后續試驗超聲波功率為240 W、280 W和320 W。

2.2.5 提取時間 隨著提取時間延長黃酮提取率呈先升后降趨勢；各處理青果黃酮的提取率為2.87%～3.45%，其中，提取時間為80 min時黃酮提取率最大，60 min時其次，100 min時最低；依次為80 min>60 min>20 min>40 min>100 min。提取時間為80 min時黃酮提取率最大，其原因可能是隨提取時間越久，對青果細胞壁作用越徹底，黃酮溶出越完全，使得產率增大，但當黃酮提取完成后，黃酮的降解起主導作用，同時溶劑逸散也會增加，從而使得黃酮提取率降低[23]。因此以提取時間80 min最佳。后續試驗提取時間為60 min、80 min和100 min。

2.2.6 提取溫度 隨著提取溫度升高，青果黃酮提取率呈先升后降趨勢；各處理青果黃酮的提取率為3.05%～3.18%，其中，提取溫度為60℃時黃酮提取率最大，70℃時其次，30℃時最低，依次為60℃>70℃>50℃>40℃>30℃。提取溫度為60℃時黃酮提取率最大，其原因可能是溫度增高，增加了黃酮分子的運動能量，更利于其突破相鄰分子的羈絆而快速脫離束縛，使提取率增大；但溫度過高則損壞一些黃酮的結構，影響其溶解性[24]，同時，也加大其他雜質分子的溶解活性導致黃酮提取率下降。因此，提取溫度以60℃最佳。

2.3 提取工藝優化

2.3.1 優化試驗 從表2看出，17個處理青果黃酮提取率為3.17%～3.50%，其中，處理1、處理2、處理8、處理9和處理15試驗條件相同，均為硫酸銨用量6 g/30mL、超聲波功率280 W、提取時間80 min，其青果黃酮提取率最高，為3.46%～3.50%；處理14和處理17其次，分別為3.42%和3.41%。各處理青果黃酮提取率依次為處理1>處理2>處理8=處理9=處理15>處理14>處理17>處理10>處理3>處理12=處理16>處理6>處理7>處理11>處理13>處理5>處理4。

表2 青果黃酮提取的響應面試驗設計及結果

2.3.2 曲面模型與方差分析 經對上述結果進行多元回歸擬合得到青果黃酮提取率(Y)與提取因素硫酸銨用量(A)、超聲波功率(B)和提取時間(C)的回歸方程：

Y=3.47+0.047A+0.007 5B-0.010C-0.005AB+0.01AC-0.11BC-0.094A2-0.094B2-0.073C2

表3 響應模型的方差分析結果 Table 3 Result of vaniance analysis in the responese surface model

2.3.3 響應面因素間的交互作用 從圖2看出超聲波功率與硫酸銨用量、提取時間與超聲波功率、提取時間與硫酸銨用量相互作用對青果黃酮提取率作用的影響。

圖2 超聲波功率、硫酸銨用量及提取時間相互作用的青果黃酮提取率及其響應面與等高線

1) 超聲波功率與硫酸銨用量。功率為272～288 W時黃酮提取率出現最大值；硫酸銨用量為5.5～6.5 g/30mL時出現最大值。當超聲波功率一定時，隨著硫酸銨用量增多，黃酮提取率呈先增后減趨勢，等高線接近圓形；當硫酸銨用量一定時，黃酮提取率趨勢一致，且坡度變化較為平緩。由此可知，超聲波功率與硫酸銨用量互相作用效果不顯著，與響應模型的方差分析一致。

2) 提取時間與超聲波功率。黃酮提取率在時間為76～84 min時出現最大值，超聲波功率為272～288 W時出現最大值。在較低超聲波功率時，提取時間延長，黃酮提取率呈先增再趨于平緩，在較高超聲波功率時，隨著時間延長，黃酮提取率逐漸減少，等高線接近橢圓形。由此可知，提取時間與超聲波功率互相作用效果顯著，與響應模型的方差分析一致。

3) 提取時間與硫酸銨用量。黃酮提取率在時間為76～84 min時出現最大值，硫酸銨用量為5.5～6.5 g/30mL時出現最大值。在一定時間里，當硫酸銨用量逐漸增多時，青果黃酮提取率呈先增后減趨勢；在一定硫酸銨用量時，隨著時間增長，黃酮提取率呈先增后減趨勢，等高線接近圓形。由此得出，硫酸銨用量與時間互相作用效果不顯著，與響應模型的方差分析一致。

2.4 方案驗證

以其他條件為單因素最佳條件，在硫酸銨用量6 g/30mL、超聲波功率280 W、時間77 min時進行5次平行驗證試驗的結果表明，黃酮提取率平均為3.404%，與此條件下的理論響應值3.472%相比，相對誤差為1.95%，說明模型擬合較好，可用于指導實際操作。

2.5 黃酮化合物的理化性質

2.5.1 定性鑒定 取黃酮提取液加入NaOH后溶液呈橙色，一段時間后變為紅色，表明提取液含有二氫黃酮醇類化合物；加入Al(NO3)3時溶液變為黃色，表明含鄰二酚羥基結構；加入氨水時溶液變為棕黃色，表明含各類黃酮類化合物；加入飽和碳酸鈉時溶液變為橙色，一段時間后變為紅色，表明含二氫黃酮醇類化合物，試驗結果與文獻報道[17]一致。

2.5.2 黃酮提取物對DPPH·的清除效果 從圖4看出，在相同濃度條件下，青果黃酮清除DPPH·作用顯著優于VC和蘆丁。當處理濃度達1.0 μg/mL時，青果黃酮對DPPH·的清除率達88.04%，之后清除率基本保持不變，蘆丁與VC濃度增大時，清除自由基能力也不斷升高，但均明顯低于青果黃酮。由此可得，青果黃酮對DPPH·有很好的清除效果，抗氧化能力較強。

圖3 不同物質對DPPH·的清除率

3 討論

研究利用超聲波-雙水相提取技術提取青果中的總黃酮，提取方法更為多樣性與溫和性，避免了只利用超聲波方法的單一性，也可防止酶法中溫度過高對部分有效成分產生分解與酶失活現象。田應娟等[25]采用超聲強化提取橄欖黃酮類物質發現，在提取溫度60℃，超聲波功率350 W，乙醇體積分數70%，提取時間60 min，液料比40 mL/g的最佳提取條件下，總黃酮提取率為2.30%。阮尚全等[26]采用Box-Behnken設計優化酶法提取青果黃酮發現，在最佳提取條件[酶用量為15 U/mL，提取時間85 min，提取溫度60℃，乙醇體積分數60%，料液比1∶30 (g/mL)]下，青果黃酮提取率為3.14%。而在經該研究優化的提取條件下，青果黃酮提取率為3.304%，較之超聲波提取法[25]和酶法[26]等，該方法的黃酮提取率最較高，更有利于黃酮的提取。采用超聲波-雙水相提取青果黃酮，可為合江青果的進一步開發利用提供了理論依據和新的試驗方法。

4 結論

研究結果表明，超聲波和雙水相技術結合提取合江青果黃酮，縮短了提取時間，實現了提取與純化的同步進行。利用Box-Behnken設計得到提取的理論模型，在超聲功率為280 W、硫酸銨用量為6 g/30mL、提取時間為77 min、液料比(mL∶g)為35︰1、溫度為60℃、乙醇體積分數為70%時，青果黃酮提取率為3.404%，與理論模型值3.472%的相對誤差為1.95%；提取液中黃酮類成分定性鑒定現象明顯，且提取物對DPPH·的清除存在量效關系，清除能力強于蘆丁、VC，黃酮物質清除DPPH·效果較好。