枸杞多糖的水提醇沉法工藝優化

胡玲玲， 烏雪燕

(安康學院 化學化工學院， 陜西 安康 725000)

0 引言

【研究意義】枸杞屬茄科植物，主要產于寧夏、甘肅及新疆等地，其成熟的漿果干燥后稱為枸杞子，是一種較名貴且歷史悠久的藥食同源中藥材。中醫認為，枸杞具滋補肝腎、保健明目的功效[1-2]。藥理研究表明，枸杞含有多糖、生物堿及類胡蘿卜素、黃酮多酚等多種復雜的生物成分[3]。其中，枸杞多糖是枸杞中最主要的生物活性物質之一，具有調節免疫、清除自由基、調節血糖血脂等生理功效，因而倍受關注，也是評價枸杞質量的重要依據之一[4-5]。開展枸杞多糖等活性物質提取方面的研究，對擴大其在食品加工、生物制藥等方面的開發利用具有現實意義。【前人研究進展】提取植物多糖的方法主要有傳統的水提醇沉提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法和超臨界流體萃取法等[6-12]。郭錦濤等[10]研究發現，經53%vol白酒浸泡20 d后枸杞浸提酒的黃酮含量和多糖含量分別為0.031 mg/mL和5.83 mg/mL，浸提效果最佳。許英瑞等[11]研究得到超聲提取黑枸杞(LyciumruthenicumMurray)多糖的最佳工藝條件：液料比(mL∶g)41.50∶1，提取時間16 min，超聲功率418 W，此時黑枸杞多糖的提取率達14.13%。吳佳欣等[12]對枸杞多糖提取工藝進行優化，提出其最佳提取工藝：液料比(mL∶g)36.6∶1，溫度93.2℃，時間3.9 h，此時多糖提取率為4.28%。【研究切入點】每種方法各有特點，酶法除考慮影響酶活性的各種因素外，還要考慮酶濃度、底物濃度等因素對提取物的影響，對實驗條件要求較高；微波法一般對水的穿透深度為2～3 cm，穿透深度有限；超臨界流體萃取法需要有高溫高壓的技術條件，均不利于工廠化生產。傳統的水提醇沉法提取時間長，溫度高，對多糖的生物活性有不利影響，而超聲波空化效應可以縮短提取時間，避免長時間的高溫提取操作對有效成分的破壞。【擬解決的關鍵問題】采用單因素試驗與正交試驗相結合，以枸杞多糖的得率為評價指標，通過超聲波輔助優化傳統水提醇沉法提取工藝，以期為枸杞多糖的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞 中藥材枸杞，產于寧夏中寧縣，購于安康。

1.1.2 儀器 主要儀器包括Uv-6100PC紫外可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)，FW177中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，HH-2型電熱恒溫水浴鍋(上海科偉永興儀器有限公司)，KH-100E超聲波清洗儀(昆山禾創超聲波儀器有限公司)，FD-1A-80臺式冷凍干燥機(上海予騰生物科技有限公司)，AE224電子分析天平(上海舜宇恒平儀器有限公司)，DZF-6020真空干燥箱(蘇州江東精密儀器有限公司)。

1.1.3 試劑 無水乙醇(AR)(天津市天力化學試劑有限公司)，苯酚(AR)(天津市東麗區新中村)，無水葡萄糖(AR)(西王藥業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理 取中藥材枸杞50 g于真空干燥箱中60℃干燥12 h，碾碎過篩(24目)，用100 mL有機溶劑(V氯仿∶V甲醇=2∶1)60℃下回流2 h，抽濾，濾渣用相同的方法再重復處理1次，充分除去枸杞中的色素、脂類及低聚糖[13]。濾餅冷凍干燥制成枸杞樣品并稱重(ms)，備用。

1.2.2 繪制標準曲線 無水葡萄糖粉末干燥至恒重，準確稱量25 mg，去離子水溶解后，轉移至250 mL的容量瓶并定容，配制成濃度為100 mg/L葡萄糖標準溶液。分別移取0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL的葡萄糖標準溶液于6個10 mL具塞比色管中，補去離子水至2.00 mL。再分別加入 6%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸6 mL，充分搖勻后，90℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，然后采用紫外分光光度計在波長(λ)300～800 nm掃描，λ=490 nm處有最大吸光度。因此，可在此處測定枸杞多糖的吸光度[14-15]。以吸光度值為縱坐標(y)、葡萄糖標準溶液濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 不同因素對枸杞多糖得率的影響 用精度0.01 g的電子秤準確稱取枸杞樣品2.00 g置于100 mL圓底燒瓶，按照超聲提取→濃縮→冷凍干燥→測定吸光度并計算得率的流程進行單因素提取試驗，分別考察液料比(mL∶g)、超聲提取時長(min)、超聲溫度(℃)及提取次數等因素對提取得率的影響。

1) 提取時間。分別設定為10 min、15 min、20 min、25 min和30 min；試驗條件：液料比為20∶1，提取溫度設定為50℃。

2) 提取溫度。分別設定為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃；試驗條件：液料比為20∶1，超聲提取時長設定為25 min。

3) 液料比(mL∶g)。分別設定為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1；試驗條件：超聲提取溫度和提取時長固定為50℃和25 min。各處理2次重復提取，合并濾液并用旋轉蒸發儀濃縮至10 mL，加入40 mL 95%乙醇，4℃下靜置沉淀24 h，抽濾，濾渣分別用少量乙醇、丙酮各洗滌1次，得枸杞多糖粗產品。

1.2.4 正交試驗設計優化提取工藝 根據上述單因素試驗結果，采用L9(34)正交試驗設計(表1)，對枸杞多糖水提醇沉法提取工藝中主要影響因素液料比，超聲提取時長和提取溫度進行優化，篩選最佳提取工藝。

表1 枸杞多糖提取試驗因素及水平

1.2.5 測定枸杞多糖含量 枸杞粗多糖凍干品，用去離子水溶解配置成250 mL多糖溶液，吸量管移取1.00 mL多糖溶液于10 mL容量瓶中，去離子水定容。再從中取出1.00 mL溶液于比色管中補去離子水至2.00 mL。然后加入6%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸6.00 mL，充分搖勻，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，測量其吸光度并計算枸杞多糖的提取率。

式中，C由回歸方程所得枸杞粗多糖的濃度(mg/L)，n為稀釋倍數，D為換算系數(ms/50)；m為枸杞供試品的質量(g)。

2 結果與分析

2.1 枸杞多糖的標準曲線

以吸光度值為縱坐標(y)、葡萄糖標準溶液濃度(x)為橫坐標繪制得到標準曲線(圖1)。經擬合得回歸方程：

圖1 枸杞多糖的標準曲線

y=4.0657x+0.096 9(R2=0.999 3)

說明，葡萄糖標準溶液的濃度在10～60 mg/L，吸光度與葡萄糖濃度存在良好的線性關系。

2.2 不同提取因素處理枸杞多糖的提取率

從圖2看出，不同提取時間、溫度和液料比處理枸杞多糖的提取率存在差異。

圖2 不同提取時間、溫度和液料比處理枸杞多糖的提取率

2.2.1 提取時間 不同處理枸杞多糖的提取率為8.68%～10.51%，其中，提取時長為20 min時多糖提取率最高，25 min時其次，10 min時最低，依次為20 min>25 min>30 min>15 min>10 min。枸杞多糖提取率隨提取時間的增加呈先升后降趨勢，當提取時長為20 min時達最大，之后下降，可能是隨著提取時間的增長，多糖在溶劑中不斷溶出；隨時間延長，其他雜質在溶劑中溶出也快速增多，使得多糖提取率下降。表明，20 min是較為合適的提取時長。因此，選取提取時間15 min、20 min和25 min進行后續試驗。

2.2.2 提取溫度 不同處理枸杞多糖的提取率為8.67%～10.66%，其中，提取溫度為60℃時多糖提取率最高，50℃時其次，30℃時最低，依次為60℃>50℃>70℃>40℃>30℃。隨溶劑溫度升高，多糖提取率呈先升后降趨勢，在提取溫度為60℃時達最大，之后下降，可能是枸杞多糖在低溫時溶出較少，隨溫度升高，多糖溶出逐漸增大；溫度較高時多糖易降解，從而使多糖提取率下降。表明，最佳提取溫度以60℃較為適宜。因而，選取提取溫度50℃、60℃和70℃進行后續試驗。

2.2.3 液料比 不同處理枸杞多糖的提取率為8.61%～10.71%，其中，液料比(mL∶g)為20∶1時多糖提取率最高，25∶1時其次，10∶1時最低，依次為20∶1>25∶1>30∶1>15∶1>10∶1。隨液料比增大，多糖提取率呈先升后降趨勢，當液料比大于20∶1之后，提取率又略有下降。原因可能是液料比太小時，溶劑不能完全浸潤藥材，多糖提取不完全。為提高效率，節省能耗，選擇20∶1的液料比較為適宜。因而，選取液料比15∶1、20∶1和25∶1進行后續試驗。

2.3 枸杞多糖提取條件優化

從表2看出，9個處理枸杞多糖提取率為8.79%～10.66%，其中，處理5(A2B2C3)，即液料比20∶1，提取溫度60℃，提取時長25 min時枸杞多糖提取率達最高，為10.66%；處理4(A2B1C2)和處理9(A3B3C2)，即液料比20∶1，提取溫度50℃，提取時長20 min時和液料比25∶1，提取溫度70℃，提取時長20 min時枸杞多糖提取率其次，分別為10.34%和10.32%。從表3和表4可知，各因素對枸杞多糖提取率的影響為A因素(液料比)>C因素(提取時間)>B因素(提取溫度)；液料比和超聲提取時間對提取率影響顯著，而提取溫度對提取率無顯著影響。由K值可知：枸杞多糖提取最佳操作方案為A2B2C2，即超聲輔助提取枸杞多糖的最優方案為加入所稱量的枸杞供試品質量20倍的蒸餾水，在60℃條件下超聲提取20 min。

表2 枸杞多糖提取正交試驗設計及結果

表3 枸杞多糖提取條件正交試驗結果的極差分析結果

2.4 方案驗證

由于正交試驗設計中缺少A2B2C2的試驗方案，需進行重復性驗證試驗對優選出的A2B2C2處理進行可信性檢驗。從表4看出，在此最佳方案下提取枸杞多糖的平均提取率為10.61%，與正交設計中方案5的提取率接近，且RSD僅為1.13%，說明，優選出的提取方案(A2B2C2)，即加入稱量的枸杞供試品質量20倍的蒸餾水，在60℃條件下超聲提取20 min合理、可行。

表4 枸杞多糖正交試驗方差分析結果

表5 枸杞多糖提取的重復性試驗結果

3 討論

水提醇沉法在中藥材的提取分離中應用較廣，該研究利用枸杞多糖溶于水的性質進行水提，隨提取溫度的升高，提取時間的增長，枸杞多糖在提取液中溶解度提高的同時，多糖的水解率也會提高，使得枸杞多糖的提取率較低。超聲波能夠在植物組織內部形成空化作用，以及本身的振動作用大大促進了多糖的溶解、擴散，不僅縮短了提取時間，也不需要太高的提取溫度。在提高提取率的同時，對多糖結構的破壞較小。將超聲法與傳統的水提法結合，保留了水提的優點，縮短了提取時間長，提高了提取率，且提取過程簡單、易操作。該研究經優化得到提取枸杞多糖的最佳方案為液料比(mL∶g)20∶1，超聲提取溫度60℃，超聲提取時間20 min。較之吳佳欣等[12]的研究，該研究既減少了液料比，降低了提取溫度，縮短了提出時間，還提高了多糖提取率。

4 結論

試驗采用傳統的水提醇沉結合超聲波法提取枸杞多糖，選擇液料比、提取時間和提取溫度3個因素，結合L9(34)正交表優選枸杞多糖的提取方案。提取枸杞多糖的最佳方案為液料比(mL∶g)20∶1，超聲提取溫度60℃，超聲提取時間20 min。在此方案下，枸杞粗多糖的提取率較高，均值達10.61%。提取線路簡單、易操作，多糖提取率較高，為枸杞粗多糖進一步純化研究奠定了基礎。