陸地棉葉片發育相關基因GhRH39 克隆與功能分析

卞英杰，王寒濤，魏恒玲，張蒙，李弈，喻樹迅

（中國農業科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室,河南 安陽 455000）

棉花是我國最重要的紡織原料作物，高產一直以來都是棉花育種的首要目標。 光合作用是棉花產量形成的關鍵因素之一[1]，葉片發育狀況很大程度上決定了光合作用的效率。 因此，研究棉花葉片發育相關基因的表達和功能，明確其在葉綠體光合系統建立過程中的作用，對推動棉花高光效種質資源創新具有至關重要的意義[2]。

葉綠體是植物特有的負責光合作用的半自主性細胞器，具有雙層膜結構，存在于葉肉細胞中，能夠進行DNA 自我復制，能獨立合成自身需要的小部分蛋白質，但絕大部分葉綠體蛋白質由核基因編碼。 葉綠體的形成與發育是一個高度復雜的過程[3-4]。 該過程中如果葉綠體基因表達、蛋白質加工與運輸、類囊體形成、質核信號轉導等任一環節異常， 均有可能導致葉綠體發育不良、光合色素合成受阻。 光合色素是光能吸收和能量轉換過程中至關重要的物質，其含量降低會造成光合能力下降，進而導致作物產量和品質降低。

RNA 解旋酶是一類利用ATP 水解產生的能量打開RNA 超螺旋結構的酶， 廣泛存在于所有生物體中[5-6]，調控多種RNA 代謝過程，如RNA合成、翻譯起始、RNA 剪接、rRNA 加工、核糖體組裝、mRNA 輸出及降解。 根據其保守序列特征可分為5 個家族， 分別為SF1、SF2、SF3、SF4 和SF5。其中，具有高度保守的氨基酸序列D-E-A-D（Asp-Glu-Ala-Asp，天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸） 的DEAD-box 亞家族是SF2 家族的成員[7]。 DEAD-box RNA 解旋酶亞家族的功能涉及生命活動的各個層面[8-9]。近年來研究表明DEADbox RNA 解旋酶參與葉綠體發育過程。Wang 等[10]利用煙草轉移DNA（Transfer DNA，T-DNA）插入突變體鑒定出1 個葉綠體定位的DEAD-box RNA 解旋酶基因VDL， 突變體植株vdl葉片表現斑狀失綠，細胞組織學觀察發現葉片失綠部分缺少柵欄組織，透射電鏡觀察發現葉綠體發育受阻，含有大量未分化的質體。孔榮榮[11]利用水稻溫敏白化突變體tcd33圖位克隆DEAD-box RNA解旋酶基因TCD33。 在20 ℃下，tcd33突變體幾乎觀察不到完整的葉綠體，并且有大量氣泡結構。 對葉綠體發生、光合膜系統建立、光合色素合成相關基因進行熒光定量聚合酶鏈反應（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析，發現該基因突變影響葉綠體早期發育和光合系統建立等發育過程。 Nishimura等[12]利用擬南芥突變體nara12圖位克隆AtRH39。該基因突變造成植株生長緩慢、葉片黃化、光合作用相關酶活性下降，葉綠體基因翻譯效率嚴重降低，但轉錄過程沒有受到影響。 進一步試驗證明， 該基因參與了葉綠體核糖體的組裝過程，該基因突變影響葉綠體翻譯系統正常功能，使葉綠體內蛋白質合成過程受阻， 造成葉綠體發育異常，影響光合系統建立。

為了研究陸地棉中DEAD-box RNA 解旋酶在葉片發育過程中的功能，將擬南芥AtRH39基因編碼序列比對到陸地棉基因組，獲得同源性最高的基因Gh_D06G1215，并將其命名為GhRH39。本研究對GhRH39進行基本生物信息學分析、表達模式分析以及病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS） 表型分析等， 驗證GhRH39基因在葉綠體發育、光合色素合成過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗中所用棉花材料為陸地棉遺傳標準系TM-1。基因沉默試驗材料在溫度為22 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗的溫室培養；基因表達分析所用材料種植在中國農業科學院棉花研究所東場試驗田（河南省安陽縣），大田常規管理。 RNA 提取使用北京天根生化科技公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，cDNA 反轉錄使用寶生物PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，qRT-PCR 分析使用SYBPremix Ex TaqTM熒光定量試劑盒， 聚合酶為諾唯贊生物公司2×Phanta Master Mix， 測序載體為pCE-Zero 載體，VIGS 干擾表達載體為pYL-156，輔助侵染載體為pYL-192， 大腸桿菌感受態為DH5α 菌株，農桿菌感受態為GV3101 菌株，所用抗生素有卡那霉素和利福平。 引物合成及片段測序由河南尚亞生物技術公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1GhRH39 基因的克隆。 根據GhRH39基因的編碼序列在Oligo 7 軟件中設計目的基因擴增引物。 將PCR 擴增產物進行膠回收后連接到pCE-Zero 載體上， 轉化大腸桿菌感受態DH5α，經PCR 鑒定的陽性菌送往河南尚亞生物技術公司測序，以獲得GhRH39序列。

1.2.2生物信息學分析。 使用GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/） 進行基因結構展示， 使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）進 行 蛋白質保守結構域展示， 使用ExPASY 網站Prot-Param 工具（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質基本理化性質，使用ChloroP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/） 預測蛋白質亞細胞定位信號，使用PlantCARE 數據庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測[13]，使用DNAMAN軟件進行蛋白質多序列比對，使用MEGA 7 軟件構建進化樹[14]。

1.2.3取樣。 組織表達模式取樣包括：大田種植的TM-1 的根、莖、頂芽（以上組織材料均取于五葉期）和花瓣（開花當天）、纖維（開花后10 d）、不同發育時期葉片（五葉期取倒一葉至倒五葉，記為D1～D5）。 VIGS 植株qRT-PCR 分析取樣：選取pYL-156:00 植株與pYL-156:GhRH39 陽性植株相同大小的葉片， 以pYL-156:00 空載植株作為對照。 每個樣本3 次生物學重復，檢測合格后放置于－80 ℃冰箱保存。

1.2.4反轉錄與熒光定量分析。 將檢測合格的RNA 進行反轉錄，qRT-PCR 反應體系準備和反應程序設定按照試劑盒說明書進行，儀器型號為Applied Biosystems 7500。 內參基因為GhActin，每個反應設置3 個重復， 結果采用2－△△CT計算基因的相對表達量[15]。

1.2.5VIGS 載體構建與侵染試驗。 使用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切pYL-156 載體，獲得線性載體，從TM-1 葉片cDNA 中克隆到相應基因的VIGS片段。 用同源重組技術將GhRH39的VIGS 片段插入到線性載體，轉入大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆測序，獲得正確的單克隆，并用測序正確的質粒轉化農桿菌GV3101[16]。 將攜帶pYL-156:GhRH39、pYL-156:00 （空 載 體）、pYL-156:PDS（陽性對照）和pYL-192（輔助侵染）的農桿菌在含卡那霉素和利福平（質量濃度均為50 mg·L－1）的LB 液體培養基中過夜培養， 至OD600值為1.5～2.0（OD600為600 nm 下的吸光值），離心后用重懸液（2-嗎啉乙磺酸0.5 mol·L－1＋乙酰丁香酮200 mmol·L－1＋MgCl20.5 mol·L－1） 重懸菌體，并調整OD600在1.5 左右，常溫黑暗下靜置3 h，然后分別將pYL-156:GhRH39、pYL-156:00、pYL-156:PDS與pYL-192 菌液等體積混合， 注射到第一片真葉未展平的棉花子葉。

1.2.6色素含量測定。 分別稱取pYL-156:00（CK，空載體對照）植株與pYL-156:GhRH39 陽性植株新鮮葉片0.1 g 左右放入離心管中， 加入25 mL 無水乙醇/ 丙酮（體積比1∶1）混合液，將離心管放到4 ℃黑暗條件下過夜，直至葉片完全白化為止，搖勻，取上清液，測定662 nm、645 nm和470 nm 下的吸光值， 試驗進行3 次生物學重復， 每個重復測量3 次取平均值。 按Lichtenthaler 等的方法， 計算葉片中葉綠素a（Chlorophyll a，Chla）、葉綠素b（Chlorophyll b，Chlb）和類胡蘿卜素（Carotenoid，Car）的含量[17-18]。 葉綠素a 的 含 量CChla＝（11.24×OD662－2.04×OD645）×0.025／m；葉綠素b 的含量CChlb＝（20.13×OD645－4.19×OD662）×0.025／m； 類胡蘿卜素的含量CCar＝（1 000×OD470－1.90×CChla－63.14×CChlb）／214×0.025／m，其中OD662、OD645、OD470分別是662nm、645nm、470 nm 下的吸光值，m是鮮葉片質量。

2 結果與分析

2.1 GhRH39 基因克隆與序列分析

根據GhRH39基因的編碼序列 （Coding sequence, CDS）設計特異性引物，以陸地棉TM-1葉片cDNA 為模板，克隆得到GhRH39CDS（圖1A），通過無縫克隆連接到pCE-Zero 載體上，挑取陽性克隆測序。 該基因CDS 全長1 863 bp（Base pair， 堿 基 對）， 編 碼620 個 氨 基 酸。GhRH39（Gh_D06G1215） 定位在D06 染色體31 392 073～31 397 389 bp，由9 個外顯子、8 個內含子組成（圖1B）。 利用SMART 在線工具對蛋白質進行保守結構域預測， 發現其包含DEXDc（DEAD-like helicases superfamily）和HELICc（Helicase superfamily C-terminal domain）保守結構域（圖1C），表明該基因編碼DEAD-box RNA 解旋酶。

表1 本研究中涉及的引物信息Table 1 Information of the primers used in this study

2.2 GhRH39 基因基本生物信息學分析

通 過 ExPASY 網 站 ProtParam 工 具 對GhRH39編碼的蛋白質的基本理化性質進行分析。 結果顯示該基因編碼的蛋白質分子式為C3013H4961N871O889S26，共計9 760 個原子，分子質量約為68.44 kD。 理論等電點為9.90，含有63 個帶正電的氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸），63 個帶負電的氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）。 其不穩定系數為35.90，小于40，判斷該蛋白質較為穩定。該蛋白的脂肪系數為84.58，總平均親水性為－0.362。 ChloroP 在線工具預測GhRH39 蛋白質含有葉綠體定位信號。 從棉花功能基因數據庫（https://cottonfgd.org/）中調取GhRH39起始密碼子上游2 000 bp 的序列，使用PlantCARE 數據庫對其順式作用元件進行預測。 該基因啟動子區存在光響應、厭氧誘導、茉莉酸甲酯響應、MYB 轉錄因子結合、醇溶蛋白合成調節與保衛和損傷響應多種類型調控元件。 值得注意的是存在Box4、GA-motif、GT1-motif、LAMP-element 多種光響應元件（表2）。

表2 GhRH39 啟動子區順式作用元件預測Table 2 Prediction of cis acting elements in promoter region of GhRH39

通過NCBI 的蛋白數據庫搜索GhRH39 蛋白同源序列， 發現可可 （Theobroma cacao,XP_017981583.1）、擬 南 芥（Arabidopsis thaliana,NP_849348.1）、玉米（Zea mays,NP_001130422.1）、高粱（Sorghum bicolor, XP_002455046.1）、水稻（Oryza sativa, XP_015613578.1）、 小麥（Triticum aestivam,CDM81630.1）中的同源蛋白與GhRH39相似性分別為77%、61%、57%、56%、56%、55%。多序列比對結果顯示，GhRH39 及其同源蛋白的DEXDc 和HELICc 兩個結構域序列較為保守（圖2A）。 系統進化分析表明，GhRH39 與可可中同源蛋白的親緣關系最近，這與棉花和可可物種親緣關系最近[19]相一致（圖2B）。

2.3 GhRH39 表達模式分析

提取TM-1 不同組織的RNA 并反轉錄為cDNA 檢測GhRH39基因的表達情況。 結果表明，GhRH39基因在根、莖、葉、頂芽、花瓣、纖維等組織中均有一定表達， 發現在葉片中表達量最高，在頂芽表達量次之（圖3A）。 為進一步研究GhRH39基因在不同發育時期葉片的表達情況，選取五葉期主莖倒一葉至倒五葉檢測其表達量。發現其表達量在倒一葉至倒三葉中逐漸上升，而在倒四葉、倒五葉中下降（圖3B），表明GhRH39表達量隨著葉片發育進程而變化。

2.4 GhRH39 基因沉默分析

為了探索GhRH39基因在棉花葉片發育過程中的功能，利用VIGS 技術對其進行沉默。陽性對照植株葉片呈白化表型時， 檢測后共得到27株陽性株。 qRT-PCR 分析結果表明：陽性沉默株系中GhRH39基因表達顯著降低， 沉默效率近40%（圖4A）， 并在新生真葉中出現了失綠表型（圖4C）。 光合色素含量測定發現，沉默棉株葉片中葉綠素a 和葉綠素b、 類胡蘿卜素含量均顯著降低（圖4B），說明GhRH39的沉默會降低葉綠素、類胡蘿卜素含量。

為了進一步探究GhRH39基因沉默對葉綠體發育、光合色素合成的影響，對葉綠體發育相關基因及光合色素合成通路基因進行表達檢測。選取的葉綠體發育相關基因包括：類囊體形成相關基因FZL、 葉綠體RNA 聚合酶啟動相關基因SIGF、 光系統Ⅱ分解代謝與修復相關基因FTSH1、葉綠體蛋白質降解相關基因CLpR；選取的光合色素合成相關基因包括：葉綠素合成相關基因HEMB1、CHLI、CHLG， 類胡蘿卜素合成相關基因PDS。 結果顯示GhRH39沉默植株中，葉綠體發育相關基因FZL、FTSH1表達量降低，SIGF、CLpR表達量變化不顯著， 說明GhRH39基因表達受到抑制后，葉綠體發育的部分過程受到一定程度的干擾（圖5A）。 色素合成相關基因的表達都下降， 說明GhRH39基因對光合色素合成影響較大（圖5B）。

3 討論

植物中解旋酶基因家族是一個龐大的基因家族，除具有持家基因的功能外，在生長發育、抗旱、抗冷、耐鹽等許多方面也發揮重要調控功能[20-22]。 Chen 等[23]從二倍體棉種雷蒙德氏棉基因組中共鑒定了161 個RNA 解旋酶基因， 其中包括51 個DEAD-box 解旋酶基因， 亞細胞定位預測顯示它們分布在細胞質、細胞核、葉綠體、線粒體等多種細胞器中，說明該家族成員功能的多樣性。 He 等[24]通過對72 個PPR-DYW 蛋白進行亞細胞定位預測， 驗證了葉綠體定位的GhYGL1d在葉綠體發育過程中的功能。預測顯示，GhRH39的N 端具有葉綠體定位信號，說明其可能在葉綠體發育過程中行使功能。 組織表達試驗證明，GhRH39在檢測的所有組織中都表達，但在葉片中的表達量最高，且GhRH39表達量會隨著葉片的發育而變化，進一步證明GhRH39參與了葉片發育。 另外，GhRH39啟動子區存在干旱誘導、防衛與脅迫響應及損傷響應等多種與逆境相關的元件，暗示GhRH39可能在逆境響應中發揮一定的功能。

擬南芥中AtRH3、AtRH22、AtRH26、AtRH39、AtRH50 等5 個DEAD-box 成員被證明定位于葉綠體[3,25]，其中只有AtRH39 被證明參與葉綠體發育。AtRH39基因突變體nara12植株矮小，光合作用相關酶類活性降低， 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/ 加氧酶大小亞基豐度降低。 試驗證明AtRH39參與葉綠體23S rRNA 加工過程，該基因突變會造成葉綠體蛋白質合成過程受阻，影響葉綠體發育[12]。 水稻與煙草中DEAD-box 解旋酶基因OsTCD33與VDL基因突變后，葉綠體中形成大量的空泡結構和未分化的質體，DEAD-box 解旋酶可能參與葉綠體膜系統建立的過程[10-11]。GhRH39基因表達受到抑制后，參與葉綠體發育相關的基因表達量出現一定程度的下降，而參與光合色素合成相關的基因表達量全部顯著降低，推測GhRH39可能參與葉綠體某些代謝通路，影響葉綠體發育， 進而造成光合色素合成受阻，但對光合色素的合成可能沒有直接的調控功能。 類囊體形成相關基因FZL表達量顯著降低， 說明GhRH39可能參與了光合膜系統建立的過程。GhRH39 與AtRH39 蛋白相似性為66%， 序列相似性說明功能的相似性，GhRH39可能也參與了23S rRNA 加工過程。

4 結論

從陸地棉中鑒定了1 個DEAD-box RNA 解旋酶基因GhRH39， 位于D06 染色體， 編碼620個氨基酸。 表達模式分析表明，該基因在葉片中表達量最高， 且其表達量隨著葉片發育而變化。GhRH39基因沉默陽性棉株的葉片中葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均下降，一些葉綠體發育和光合色素合成相關基因下調表達，表明GhRH39在葉綠體代謝、光合色素合成等葉片發育過程中發揮著一定的功能。