淺談分子生物學在農田土壤微生物多樣性研究中的應用

何亦男

摘? ? 要：隨著人們對微生物研究的深入，傳統的農田土壤微生物分離培養與鑒定方式逐漸暴露出問題，很難滿足深入了解微生物的生態學特性與多樣性的需求。研究農田土壤多樣性的過程中應用分子生物學，不僅能獲取農田土壤微生物群落的更多相關信息，還可以解決傳統研究方式無法培養農田土壤微生物的問題。闡述了農田土壤微生物多樣性的定義，介紹了研究農田土壤微生物多樣性的重要意義，對分子生物學在農田土壤微生物多樣性研究中的應用進行了具體分析，希望為分子生物學在農田土壤微生物多樣性研究中的應用提供借鑒。

關鍵詞：分子生物學;農田土壤微生物;多樣性;重要性;應用

文章編號： 1005-2690（2021）14-0091-02? ? ? ?中國圖書分類號： S154.3? ? ? ?文獻標志碼： B

微生物在整個地球物質循環中充當著生產者與分解者的角色，是延續生命的關鍵。人類對于農田土壤微生物多樣性的研究絕大多數還處于未知狀態，研究農田土壤微生物多樣性可以幫助人類有效開發微生物資源、改善環境污染問題、維持生態服務功能以及促進農田土壤可持續性利用。

人類最初采用平板計數法來研究農田土壤微生物多樣性，但是這種方式存在一定的問題，比如在研究時會忽略不可培養微生物，使生長速度快、產孢量大的微生物數量增加等[1]，后來逐漸研究出其他方式幫助人類認識農田土壤微生物多樣性。目前應用比較普遍的是以分子生物學為基礎的分子技術，比如核糖體間隔序列分析、核酸分子雜交技術等。在高通量測序技術不斷發展的同時，其在農田土壤微生物多樣性領域的運用也越來越深入。

1? ?農田土壤微生物多樣性的定義

農田土壤微生物群落之間在種群與種間上具有差異性，在維持農田土壤的質量與生態系統的平衡等方面發揮著重要作用。

農田土壤生態系統的穩定、和諧以及其對微生態環境惡化的緩沖能力與農田土壤微生物群落的多樣性、結構均勻性緊密相關。農田土壤微生物的多樣性表現為生物在物種、遺傳、結構及功能方面的差異與變化，體現了微生物群落會受到農田土壤生態機制因素的影響[2]。同時，也可以將農田土壤微生物多樣性理解為微生物生命豐富，用農田土壤生物區的變化與生物化學過程之間的關系來解釋。

2? ?農田土壤微生物多樣性的重要性

隨著人類社會的發展，土地資源的需求越來越大、破壞也越來越嚴重，地球生態系統所提供的資源與其恢復能力有限。陸地上所有生態系統的結構與功能的基礎就是農田土壤，其最重要的構成部分之一是農田土壤微生物，能夠幫助農田土壤進行有機質分解、腐爛、繁殖等生化活動，是促進農田土壤有機質轉化與養分循環的關鍵因素。

除此之外，農田土壤微生物是顯示農田土壤肥力活性水平的重要指標，是儲備養分的“倉庫”，是植物生長所需養分的主要來源，在農田土壤生態系統中發揮著不可或缺的作用[3]。

植物多樣性與農田土壤微生物多樣性之間有緊密的聯系，植物通過影響農田土壤環境，影響農田土壤微生物的多樣性與構成，農田土壤微生物的多樣性及構成代表著對生態環境的適應能力。重金屬、殺蟲劑這種對植物或動物有害的物質，一旦使用劑量超過規定限度，就會對農田土壤微生物多樣性安全產生威脅。在此基礎上，有專家學者提議利用農田土壤微生物與各種污染物之間的反應，來幫助確定農田土壤污染與制定農田土壤環境容量標準。所以，加強對農田土壤微生物多樣性的研究非常重要。

3? ?分子生物學在農田土壤微生物多樣性研究中的應用

3.1? ?農田土壤微生物 DNA 復性動力學分析

研究顯示，微生物多樣性越復雜，其DNA的同源性就越差，復性率就越低。所以，可以通過測定群落的DNA同源性與復性率得到農田土壤微生物的群落構成和遺傳多樣性。

Torsvik V等研究者利用DNA復性動力學分析法對不同程度重金屬污染的農田土壤中微生物多樣性的變化進行研究，結果表明，沒有被污染的對照農田土壤中有16 000個細菌基因組，低度重金屬污染的農田土壤中含有6 400個細菌基因組，高度重金屬污染的農田土壤中含有2 000個細菌基因組，通過分析可知，農田土壤被重金屬污染的程度越高，微生物多樣性越少[4]。但是需要注意這種方式的分辨率較低，單純使用此方法，只能得到農田土壤微生物群落的大致差異，并不能表明其多樣性的變化，想要得到確切的結果，需要與核酸分子雜交技術等相結合。

3.2? ?核酸分子雜交技術

核酸分子雜交技術是在20世紀70年代新出現的一種分子生物學技術。以核酸分子堿基互補配對原理為基礎，通過將待測樣品的DNA或RNA與特異性探針雜交形成新分子[5]。

因為核酸分子雜交技術具有較高的靈敏性與特異性，從出現后就被廣泛運用于研究農田土壤微生物的多樣性。RNA基因探針、編碼代謝酶基因探針等都是經常應用于研究的探針，尤其是近幾年發展起來的熒光原位雜交技術，是進行不可培養微生物群落多樣性研究的常用方式。

3.3? ?基于PCR的分子生物學研究技術

3.3.1? ?變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳（DGGE/

TGGE）

通過使用化學變性劑或溫度處理DNS雙鏈分子，從而將其分離成序列不同但長度相等的DNA片段，依據電泳條帶的數量和位置大概確定農田土壤中微生物的類別，粗略分析農田土壤微生物多樣性。

DGGE/TGGE技術可以同時測定不同農田土壤中微生物群落的組成與變化情況，具有較高的靈敏性、可重復性、迅速性，應用范圍較廣。但是DGGE/TGGE技術并不能檢測到所有的微生物多樣性，尤其是很難檢測到劣勢的微生物種群。

3.3.2? ?單鏈構象多態性（SSCP）

堿基的變化會引起單鏈DNA構象的變化，不同空間構象的單鏈DNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型也不一樣，以此辨別大小相同但二級結構不同的PCR產物[6]。

SSCP技術在研究根系微生物、受污染的農田土壤微生物等的多樣性方面已經被廣泛應用。該技術比傳統的方式更加節約時間、節省成本，降低了誤差，適用于分析微生物群落的組成結構。

3.3.3? ?擴增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）

在PCR選擇性擴增核糖體DNA片段的基礎上，分析核糖體DNA限制性酶切片段長度的多態性。此技術不被菌株是否為純培養所限制，不會受到宿主的干擾，因此，其效率較高、特異性較強，多被運用于發現新物種、鑒定微生物、檢測遺傳性等。

3.3.4? ?隨機引物擴增多態性方法（RAPD）

RAPD利用隨機引物，且引物對農田土壤微生物群落的DNA沒有特異選擇性[7]。所以，農田土壤微生物群落DNA序列組成的差異性，可以通過擴增的條帶數間接反映出來。擴增的條帶數越少，則DNA序列越簡單，充分顯示了農田土壤微生物群落序列多樣性的某一側面，但是并不能展示出群落DNA序列相對多度的信息。

3.3.5? ?擴增片段長度多態性（AFLP）

AFLP是基于PCR和RFLP的一種DNA指紋技術[8]。此技術集合PCR的高效性與RFLP的可靠性，利用切割兩種以上的酶形成不同酶切位點的限制酶切片段，在其上添加雙鏈人工接頭，并結合引物與酶切片段識別序列，實現選擇性擴增。此方法可以更好地展示微生物的多樣性，由于AFLP標記數目從理論上來說是沒有限制的，所以具有較好的重復性[9-11]。

4? ?結語

分子生物學技術在農田土壤微生物多樣性研究中的應用，為進行農田土壤領域的研究工作提供了重要的技術支持與更廣闊的探索空間，因此，將分子生物學與其他方式相結合，將推動農田土壤微生物多樣性研究工作的發展。

參考文獻：

[ 1 ] 吳麗莉.淺談分子生物學在農田土壤微生物多樣性研究中的應用[J].黑龍江教育（理論與實踐），2017（Z2）：81-82.

[ 2 ] 曹萬舉，隋心，韓士杰，等.分子生物學技術在農田土壤微生物多樣性中的應用[J].Bioprocess，2018，3（3）：23-28.

[ 3 ] 陳慧清，李曉晨，于學峰，等.農田土壤生態系統微生物多樣性技術研究進展[J].地球與環境，2018，46（2）：204-209.

[ 4 ] Ruth-Anne Sandaa，Torsvik V，Enger I，et al.Analysis of bacterial communities in heavy metal-contaminated soils at dif-ferent levels of resolution[J].FEMS Microbiology Ecology，2019，30（3）：237-251.

[ 5 ] 王新珍，王鳳花，孫瑞波，等.高通量測序技術在微生物分子生態學研究中的應用[J].中國生態農業學報，2018，26（10）：174-181.

[ 6 ] 李婷婷，張西美.全球變化背景下內蒙古草原農田土壤微生物多樣性維持機制研究進展[J].生物多樣，2020，28（6）： 749，758.

[ 7 ] 張海龍，石竹.分子生物學技術在農田土壤微生物多樣性研究中的應用[J].中國生物學文摘，2017，21（9）：21.

[ 8 ] 李原園，張映.AFLP技術及其應用[J].國外畜牧學（豬與禽），2009，29（6）：94-96.

[ 9 ] 張寶成，邵代興，蘇麗萍，等.湄潭縣抄樂鄉農田土壤氮分布研究[J].青海大學學報，2018，36（4）：59-63.

[ 10 ] 王雅芝，齊鵬，王曉嬌，等.Meta分析中國保護性耕作對土壤微生物多樣性的影響[J].草業科學，2021，38（2）：378-392.

[ 11 ] 李慧，陳冠雄，張穎.分子生物學方法在污染土壤微生物多樣性研究中的應用[J].土壤學報，2004（4）：612-617.