NR2B啟動子區域SNP位點生物信息學探究

迮浩城，陳勇勝，陳 珊，黃 靖，賈晨曦，田大為，李增鳴

空間定向是一種特殊的定向能力，指有機體在所處環境中正確辨識方向的知覺反應或能力。哺乳動物個體能正確辨認其所處環境中的當前地點、環境、自己所處位置與周圍環境的關系，以及相互間的空間關系等。前庭功能異常導致空間定向障礙的發生，在成人前庭核中，谷氨酸能突觸介導興奮性神經傳遞，N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體不僅調節中樞前庭神經元的放電特性。對成人中樞系統的研究表明，這2種電離受體的功能特性高度依賴于它們的亞基組成。含有NR2A亞基的NMDA受體是長時程增強 (long-term potentiation，LTP)所必需的，而具有NR2B的受體表達與學習記憶和空間定向等功能密切相關[1-2]。易感基因多態性的發掘是前庭系統發病機制研究方向之一，參與空間定向、前庭損傷等許多重要的神經認知過程[1-2]。NR2B含有谷氨酸功能結合位點，是NMDA受體中最重要的一個功能亞基[3]，轉基因動物（小鼠）中樞內的NR2B含量為一般小鼠的雙倍，定向能力（尋找水迷宮）明顯增加；與未敲除NR2B小鼠比較，轉基因小鼠空間記憶能力下降，學習能力受損，提示NR2B基因對于維持哺乳動物定向功能至關重要[4-5]。基因多態性，尤其是位于啟動子區域的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）與相關疾病關聯密切[6-7]。已有研究主要就NR2B基因與神經系統疾病進行關聯分析，NR2B基因啟動子多態性位點與多種疾病相關[8-10]。本研究通過國外基因數據庫對NR2B基因SNP進行生物信息分析，發掘其易感性，對外周系統疾病的防診治提供客觀的預測和監測指標。

1 資料與方法

1.1 人NR2B基因啟動子SNP信息 人NR2B基因啟動子SNP(+1 bp～-1.5 kb)位置在染色體-12反向序列中網址（http://www.ncbi.nlm.nih.gov /nuccore/，14133022-14134522，NCBI編號: NC_000012.11），在NCBI數據庫中檢索SNP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp），發掘NR2B基因啟動子SNP（1.5kb）。搜索選項為來源：人、染色體：12號、區間：17215035 to 17217560。人NR2B基因啟動子SNP序列同源性采用加州大學醫學數據庫分析（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway），多態性位點等位基因頻率（不同人種）檢索Ensembl數據庫分析（http://www.ensembl.0rg/index.html）

1.2 方法

1.2.1 NR 2B基因啟動子SNP和臨近序列的同源率 數據庫檢索設置人NR2B基因啟動子SNP為基準，檢索其他物種的基因多態性（堿基一致）。人NR2B基因啟動子SNP同源率=等位基因一致的物種數目之和/物種總量。設置SNP（各物種）20個堿基（上下游）為同源對比序列，分析各個物種與人類之間基因多態性位點周圍序列的同源率，其平均值及標準差通過SPSS 22.0軟件進行分析。

1.2.2 基因多態性臨近序列轉錄調控元件 人NR2B基因啟動子SNP臨近序列（上、下游20個堿基）中的轉錄調控位點及元件通過TFSEARCH-on line數據庫進行分析，最低可信值（q）限定0.85。

2 結果

2.1 NR2B基因啟動子SNP及其等位基因頻率（不同人種） 在NR2B基因啟動子（+1 bp～－1.5 kb）檢索到11個SNP，命名為S1-11（如圖1），其中核心啟動子區域有3個SNP，為S9-11。結果顯示SNP的信息（SNP序列號、祖傳和新生等位基因、在染色體上的位置）（表1）；NCBI上發布的SNP（不同人種）及其等位基因頻率（Ensembl未提供S1、S-7），其中S2、S9-11對應的等位基因頻率遠低于單個等位基因頻率，亞洲人群S2中A等位基因遠高于C等位基因；歐洲人群S9中G等位基因遠高于A等位基因；S10中中國漢族與日本人群（G/A比值）最低，美國人群其次，尼日利亞種族遠高于上述人群；S11中美國人的A/G比值高于亞洲人種，提示NR2B基因啟動子SNP等位基因頻率的一個重要特性，即存在人種差異性（表2）。

圖1 NR2B基因啟動子區域上的多態性位點分布圖

表1 NR2B基因啟動子區域SNP相關信息

表2 NR2B基因啟動子區域SNP不同人種等位基因頻率

2.2 NR2B基因啟動子序列保守性與多態性位點之間的關系 UCSC-on line數據庫中，設置群體為大鼠、小鼠、狗、母牛和馬，檢索基因為NR2B，區域為啟動子區，分析指標為保守性，結果提示如圖2，目標基因啟動子區序列和基因多態性位點保守性特點為，SNP（S1～S8）距離核心啟動子越遠，保守性越低；與之相反，SNP（S9～S11）距離核心啟動子（+500 bp至+1 bp）越近，基因多態性位點所在序列的保守性越高（圖2）。

圖2 NR2B基因啟動子區SNPs保守性分析

2.3 NR2B基因啟動子SNP臨近序列同源率的對比分析 圖3（A）提示的是NR2B基因啟動子SNP臨近序列分析結果，對比序列中所列出的多態性位點等位堿基，即祖傳等位基因，來源于Ensembldatabase，其中S1、S3-8、S10共八個基因多態性位點序列同源性一致；顯示SNP祖傳等位基因的同源率要高于新生等位基因，這說明祖傳等位基因在哺乳動物中具有保守性；SNP臨近序列的同源率變化與SNP祖傳等位基因的同源率變化保持基本一致（圖3B）。

圖3 NR2B基因啟動子區域SNPs及其鄰近序列(F1-F11，上下游共20個堿基)的同源率比較

2.4 基因多態性臨近序列上潛在的轉錄結合元件和包含的轉錄調控位點 采用TFSEARCH-database預測了含基因多態性位點等位基因臨近序列上潛在的轉錄結合元件和包含的轉錄調控位點，數據顯示（表3）：含S1-5、S8-11等9個基因多態性位點不同等位基因所在序列存在轉錄結合元件和包含的轉錄調控位點，而S6不同等位基因臨近序列只能預測一個轉錄結合元件和包含的轉錄調控位點，含S7序列沒有預測到轉錄因子結合元件。

表3 SNPs上潛在的轉錄調控元件及其相結合的調控因子

3 討論

NMDA受體是中樞神經系統最重要的興奮性氨基酸受體之一[11-12]，可調節中樞前庭神經元的放電特性。NR2B含有谷氨酸功能結合位點，是NMDA受體中最重要的一個功能亞基，轉基因動物（小鼠）中樞內的NR2B含量為一般小鼠的雙倍，水迷宮定向能力明顯增加；與未敲除NR2B小鼠比較，轉基因小鼠空間記憶能力下降，學習能力受損，提示NR2B基因對于維持哺乳動物定向功能至關重。Grassi等[13]發現NMDA受體不僅調節中樞前庭神經元的放電特性，而且還與α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPA）相互作用，誘導前庭神經元間的長期增強。對成人前腦的研究表明，這兩種電離受體的功能特性高度依賴于亞基的組成。含有NR2A亞基的NMDA受體是LTP所必需的，而具有NR2B的受體是長期抑郁的。Li等[14]研究發現含有Ca的AMPA受體。2+滲透亞基（GluR1，GluR3，GluR4）是誘導這2種形式的突觸可塑性所必需的，離子型谷氨酸受體能夠在出生后編碼重力相關信息，但這些受體亞型在耳石器功能成熟中的具體作用仍有待闡明。

基因多態性的發掘是前庭系統發病機制的學說之一，參與空間定向、前庭損傷等許多重要的神經認知過程。目前運動病、前庭神經炎、良性陣發性位置性眩暈等前庭系統疾病均與環境因素與遺傳環境交互作用引起，而基因多態性的功能意義對于改變基因或蛋白的表達與修飾，從而加大個體、人群和人種之間的遺傳表性差異性，增加上述復雜疾病的發病率關系密切[6-7]。飛行人員抗暈機病能力不僅僅應關注于后期的環境鍛煉（懸梯、滾輪、四柱秋千和多維旋轉刺激），而從其發生的機制來看，先天的遺傳因素更加決定了這種能力的強弱，因此，早期的功能評估和易感性篩查更為重要。選擇易感基因啟動子區SNP位點可以從影響轉錄結合原件或改變上述基因序列從而影響基因的表達和轉錄入手，本文中選擇的SNPs均位于進啟動子并且易感基因與前庭系統基因有一定關聯性。研究結果發現S2、S9-11等位基因頻率存在人種差異性，S5位點等位基因頻率無人種差異性[15]；該易感基因啟動子區位點的保守型特點在于距離核心啟動子區的距離與保守程度成正比，這與距離核心啟動區基因多態性位點與影響基因轉錄與翻譯的概率正比的情況一致[16]，即核心啟動子的SNPs可能參與靶基因的調控與表達，在線分析提示，不同轉錄因子結合元件位于含S1-5、S8-11等九個基因多態性位點序列中，一個轉錄因子結合元件位于含S6基因多態性位點序列，這些差異可能是SNPs影響NR2B表達的重要原因之一，這些分析將為進一步研究NR2B基因啟動子區域SNPs與前庭系統疾病的關聯性提供理論基礎。