基于網絡藥理學探討清胰湯治療急性胰腺炎的作用機制

王夏雨，施繼禹，賈傲，楊振偉，崔云峰

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市南開醫院肝膽胰外科，天津 300100）

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是臨床中較為常見的外科急腹癥之一，具有發病急、進展快的特點，經常出現局部和全身并發癥，病情較重者可發生全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至出現器官功能的衰竭[1]。目前尚沒有針對AP發病的特效藥物，治療多以對癥支持治療為主[2]。中藥因其多靶點的藥理活性特征，在治療AP的實踐中相較于西藥具有更佳的療效和預后價值[3]。清胰湯（QingyiTang，QYT）及其加減方作為全國廣泛運用的AP治療方劑，在臨床實踐過程中療效顯著[4]。現已有研究顯示QYT可通過抗凋亡、減少壞死、減輕炎癥反應等途徑起到治療AP的作用[5]，但其具體治療靶點、作用機制仍待探索。本文以網絡藥理學為基礎，探討QYT治療AP的潛在分子機制，并對通過篩選得到的重要生物學進程進行實驗驗證，以期為QYT治療AP的分子機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 建立QYT化合物數據庫 通過BATMANTCM中藥系統藥理數據庫，依次檢索QYT全方中藥（柴胡、黃芩、延胡索、黃連、木香、白芍、大黃、芒硝）化學成分。根據BATMAN-TCM數據庫中藥物動力學參數，得到活性成分作為候選化合物及靶點。去重后得到與有效成分關聯的靶點1 853種，構建QYT化合物數據庫。

1.2 AP預測靶點的篩選 通過Gene Cards數據庫(https://www.genecards.org/)以“acute pancreatitis”為關鍵詞檢索，篩選收集AP相關靶點，并將疾病數據庫靶點信息進行整理。

1.3 QYT對AP的共同靶點獲取 將QYT藥物靶點與疾病靶點于Venny在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)錄入取交叉，得到藥物與疾病發生作用的共同靶點。

1.4 “中藥-活性成分-靶點”網絡模型構建 將QYT全部中藥活性成分靶點和AP疾病靶點蛋白導入至Cytoscape3.7.1軟件，生成“中藥-活性成分-靶點”的網絡圖。

1.5 藥物-疾病靶點蛋白相互作用網絡構建 將篩選得到的“QYT-AP”活性化合物成分共同靶蛋白錄入STRING 11.0[6]（https://string-db.org/）數據庫，分析得到蛋白-蛋白互相作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。

1.6 功能富集分析 將QYT治療AP的作用靶點，以Gene Symbol的格式導入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進行基因本位論功能（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。設定閾值P＜0.05，篩選具有顯著性差異的生物學過程和通路。

1.7 動物實驗

1.7.1 藥物和儀器 雨蛙肽及脂多糖購自Sigma；中藥QYT[柴胡5 g，黃芩3 g，胡黃連3 g，白芍5 g，木香3 g，延胡索3 g，生大黃（后下）5 g，芒硝3 g]購自天津市南開醫院藥房，采取水煎法制備藥物：藥液比例為1:1的QYT濃縮液；α-淀粉酶（AMS）試劑盒（淀粉-碘比色法）購自南京建成生物工程研究所；LC3、P62、β-actin抗體均購自Abcam公司。石蠟組織塊包埋機、病理切片機、攤片機、烘片機、病理染色機、全自動玻璃蓋片機、顯微鏡均為美國Leica公司。

1.7.2 實驗動物準備及分組24只體重為20～22 g雄性健康C57 BL/6小鼠（SPF級），購自北京華阜康生物科技股份有限公司[小鼠許可證號：SCXK（京）2014-0004]，飼養于天津市南開醫院試驗動物中心。適應性喂養1周后，將小鼠隨機分為正常對照組8只，AP模型組（AP組）8只，QYT+AP模型組（QYT組）8只。全部小鼠在自由飲水條件下禁食12 h后開始實驗。依據文獻[7]，采取雨蛙肽及脂多糖腹腔注射方法制備小鼠AP模型。對AP組、QYT組小鼠腹腔注射雨蛙肽（50 μg/kg），每小時1次，連續注射7次；在第7次注射的同時給予脂多糖（10 mg/kg）腹腔注射。QYT組在第1次雨蛙肽注射前1 h及第7次雨蛙素注射后1 h，予以QYT（10 mL/kg）灌胃。正常對照組小鼠予以同等次數、劑量的生理鹽水腹腔注射及灌胃。

1.7.3 標本采集與檢測 末次注藥后12 h處死小鼠，收集小鼠血清樣本。使用血清淀粉酶試劑盒檢測血清淀粉酶含量，嚴格按照說明書操作進行；切取胰腺組織標本，一部分進行固定、包埋、切片、HE染色，封片后于光學顯微鏡下觀察各組胰腺組織結構并依照Schmidt病理評分標準[8]對其嚴重程度進行評分。

1.7.4 胰腺組織自噬情況檢測 取小鼠胰腺組織1 mm3于4℃條件下用2.5%戊二醛固定2 h，經鋨酸固定、乙醇脫水、丙酮浸潤、3%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色后切片等步驟，于透射電鏡下觀察胰腺組織并拍照。

1.7.5 自噬相關蛋白表達檢測 另取部分小鼠胰腺組織，于含PMSF的RIPA裂解液中充分勻漿裂解，進行BCA蛋白定量檢測蛋白濃度后，采用Western印跡法檢測自噬標志蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62蛋白表達情況，經SDS-PAGE電泳、PVDF轉膜、封閉、發光成像等步驟，用Image J軟件分析灰度值以獲知蛋白表達水平。

1.8 統計學處理 所有數據采用Graph Pad Prism8.0.2軟件進行處理，計量資料用±s表示，通過單因素方差分析比較各組間差異，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 QYT化學成分數據庫及化學成分作用靶點數據庫的篩選 通過BATMAN-TCM數據庫檢索清胰湯全方8味中藥，以Inference Score＞20為篩選條件，柴胡共找到81種化合物，大黃58種，白芍35種，木香66種，黃芩63種，胡黃連23種，延胡索46種，芒硝（Na2SO4·10H2O)化合物信息未得到。刪除重復值后，得到QYT中含有的214個化合物，并收集活性化合物的對應蛋白靶點，刪除重復值后總共獲取1 853個蛋白靶點。

2.2 AP疾病靶點數據庫 通過在Gene Cards、CTD數據庫中檢索AP，選取Inference Score＞20分的蛋白靶點，篩選得到疾病相關靶點為1 000個。

2.3 QYT-AP共同靶點的篩選 在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入1 853個藥物靶點、1 000個疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點145個，見圖1。

圖1 QYT與AP靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the target intersection of QYT and AP

2.4 QYT中藥物活性化學成分和靶點QYT中有214個化合物，其中作用于145個藥物-疾病共同靶點的化合物有121個，前30個化合物見表1。

表1 QYT化合物表Tab 1 Basic information of compounds from QYT

2.5 QYT干預AP的PPI網絡圖 將145個QYT干預AP的靶點導入STRING數據庫，設置可信度（interaction score）為0.7，得到PPI網絡圖，見圖2。根據拓撲指標度值（degree）調節節點顏色深淺以突出核心靶點，Degree結果顯示白細胞介素6（interleukin 6，IL6）、信號轉導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、腫瘤抑制蛋白53（tumor suppressor 53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）等為QYT干預AP的核心靶點。

圖2 QYT治療AP的PPI網絡Fig 2 PPI network of QYT in treating AP

2.6 GO生物學功能分析 通過DAVID數據庫對145個共同靶點進行GO功能分析，根據FDR＜0.05進行篩選，共得到富集信息1 310條，其中生物學過程（biological process，BP）1 190條，分子功能（molecular function,MF）62條，細胞組成（cellular compo nent，CC）58條；BP、MF和CC前10條富集信息見圖3。MF分析可看出靶點主要涉及載體活性，染色質DNA結合，羰基還原酶等分子功能。CC分析得出靶點主要涉及線粒體、線粒體基質、細胞質等細胞成分。BP分析得出靶點主要涉及核因子（NF）-κB正向調節、炎癥反應、MAPK激活、JAK-STAT級聯反應等生物學過程。

圖3 QYT干預AP靶點GO功能富集Fig 3 GO function enrichment of QYT in treating AP

2.7 KEGG通路富集分析KEGG分析得到67條通路信息，依P值排序居前10位的結果見表2。

表2 KEGG富集分析潛在相關通路（前10位）Tab 2 KEGG pathway enrichment analysis for candidate related pathway targets(top10)

2.8 動物實驗部分

2.8.1 各組小鼠血清淀粉酶結果 與正常對照組相比，AP組小鼠血清淀粉酶顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），QYT組血清淀粉酶明顯低于AP組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 各組小鼠血清淀粉酶含量比較（±s）Tab 3 Comparison of serum amylase levels between groups（±s）

表3 各組小鼠血清淀粉酶含量比較（±s）Tab 3 Comparison of serum amylase levels between groups（±s）

注：AP組：急性胰腺炎模型組；QYT組：QYT給藥+AP模型組；AMY：血清淀粉酶；與正常對照組比較，*P<0.05；與AP組比較，△P<0.05

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2.8.2 胰腺組織病理變化HE結果可見正常對照組胰腺結構基本完整，組織被膜完整，細胞結構正常，排列緊密，無水腫和炎癥浸潤；AP組胰腺腺泡水腫，小葉結構破壞，間隔增寬，胰腺組織不同程度水腫壞死，伴大量炎性細胞浸潤，胰腺導管內可見出血；QYT組也可見胰腺組織損傷，但程度明顯較AP組降低，見圖4。

圖4 各組小鼠胰腺組織HE染色（100×）Fig 4 HE staining of pancreatic tissues of all groups(100×)

2.8.3 胰腺組織病理評分 與正常對照組相比，AP組胰腺組織病理評分均明顯升高，具有統計學意義，與AP組相比，QYT組各項病理評分均明顯降低，具有統計學意義（表4）。

表4 各組小鼠胰腺病理評分（±s）Tab 4 Pancreatic pathology score of mice in all groups（±s）

表4 各組小鼠胰腺病理評分（±s）Tab 4 Pancreatic pathology score of mice in all groups（±s）

注：AP組：急性胰腺炎模型組；QYT組：清胰湯給藥+急性胰腺炎模型組；與正常對照組相比，*P<0.05;與AP組比較，△P<0.05

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2.8.4 小鼠胰腺組織電鏡結果 如圖5所示，電鏡下觀察到正常對照組的腺泡細胞結構規則，基底區粗面內質網豐富；AP組中，細胞結構破壞，胞質內自噬空泡明顯增多，酶原顆粒增加，個別可見細胞核固縮，線粒體腫脹、嵴消失；QYT組的胰腺腺泡細胞超微結構病理改變程度明顯輕于AP組，細胞結構較為完整，酶原顆粒較正常對照組增多。

圖5 各組小鼠胰腺組織超微結構電鏡圖（25 000×）Fig 5 Electron microscopy images of pancreatic tissues in all groups(25 000×)

2.8.5 蛋白印跡實驗 與正常對照組相比，AP組小鼠胰腺組織的LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62表達水平均明顯升高（均P<0.001）；與AP組相比，QYT組中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、P62表達水平降低（均P<0.001），見圖6。

圖6 各組胰腺組織中自噬標志蛋白表達Fig 6 Expression of autophagy marker protein in pancreatic tissues in all groups

3 討論

自噬作為分解代謝的過程，是維持細胞穩態的重要方式之一，在胰腺炎中，自噬被激活但溶酶體降解這一過程被抑制，自噬體形成增加與溶酶體降解降低之間的不平衡導致自噬通量阻滯，會導致嚴重的腺泡細胞變性和胰蛋白酶原激活，導致AP的發生[9]。現有研究證明，QYT可通過抗凋亡，減少壞死，減輕炎癥反應等多途徑發揮治療AP的作用，其中包括通過改善腸屏障通透性緩解AP的炎癥反應[10]，減少腸道內毒素的產生和吸收，緩解AP引起的腸道屏障損傷[11]，及通過減少Ⅱ型肺泡上皮細胞的凋亡來減少重癥AP誘導的急性肺損傷等[12]。但對QYT治療AP作用機制的研究相對孤立，基于分子機制的研究較少，故本研究通過網絡藥理學的技術方法，對于QYT治療AP的作用機制進行分析，結果發現自噬是QYT干預AP的途徑之一。

通路富集分析結果顯示，QYT治療AP的信號通路共67條，其中涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、炎癥性腸病（IBD）、細胞凋亡、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Janus激酶/STAT、P53、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、MAPK等通路。其中PI3K/Akt/mTOR信號轉導途徑被認為是自噬啟動和調節的主要途徑[13]。PI3K通過磷酸化Akt，影響下游從而調節自噬。有研究表明mTOR激活后發生自噬，溶酶體重整可關閉自噬小體的形成，導致溶酶體重新形成，進入下一輪自噬[14]。AMPK通過磷酸化mTORC1等自噬相關蛋白來直接促進自噬，或通過調節轉錄因子下游的自噬相關基因的表達來間接促進自噬，硫化氫通過AMPK/mTOR途徑過度激活自噬而加重AP[15]；自噬與p53之間存在重要關系，p53激活自噬，自噬也可以通過為DNA復制和修復提供底物來抑制p53激活[16]。在QYT與AP靶點作用的活性化學成分中，大黃中的大黃素（emodin），可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導自噬[17]。大黃中的大黃酸（rhein）通過產生ROS經Fas死亡途徑和線粒體途徑誘導caspase依賴性凋亡，減弱自噬[18]。STRING結果顯示，藥物-疾病靶點主要作用于TP53、STAT3、IL-6、AKT1等靶點，IL-6通過多種互補機制調控自噬，包括抑制mTORC1的靶標和激活Akt，刺激LC3的轉化和自噬體的形成，增加自噬酶產生。有研究表明miR-148a通過下調IL-6/STAT3信號轉導抑制自噬而作用于AP[19]。STAT3可作為由IL-6激活的急性期基因轉錄增強子，通過上調自噬的負調節劑或下調必需的自噬基因，導致自噬抑制[20]。

動物實驗結果證實，在雨蛙素聯合脂多糖誘導的AP小鼠模型中，經QYT治療后AP小鼠的炎癥減輕，自噬反應減弱。

綜上所述，QYT可能通過調節自噬發揮治療AP的作用。但QYT干預自噬過程的具體通路仍不明確，需進一步完善體內外實驗，進行通路和具體作用靶點的驗證，為臨床的合理應用以及新治療方法提供思路依據。