腫瘤相關巨噬細胞和幽門螺桿菌感染在各部位Ⅲ期胃腺癌患者預后中的意義

王月潔，魏楓，任秀寶,2

（天津醫科大學腫瘤醫院1.生物技術研究室；2.生物治療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室，天津 300060）

胃癌是世界上第五大常見癌癥和全球第三大癌癥死亡原因[1]，腺癌占胃惡性腫瘤的95%以上[2]，進展期患者的5年生存率僅為7%～27%[3]，其中胃底賁門癌處于胃食管交界部，近年來較胃體癌和胃竇癌發生率有所上升[4]，且術后復發相對較多，患者預后差，嚴重影響患者的生活質量[5]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)是胃癌腫瘤微環境的重要組成部分。越來越多的研究關注胃癌的炎性微環境在胃癌發生、發展中的作用[6]。研究發現TAMs與不良預后密切相關，但亦有研究表明TAMs與預后呈正相關[7]。也有研究顯示，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）相關Tip α蛋白經激活核因子κB，誘導巨噬細胞產生腫瘤壞死因子α等炎癥因子，促進腫瘤的發生、發展[8]，同時Hp感染在胃癌中可調控TAMs極化[9]。然而，Hp感染和TAMs結合起來討論與不同部位胃腺癌的預后關系尚未闡明。因此，本研究旨在分析不同部位Ⅲ期胃腺癌組織中的TAMs相關標志物（CD68和CD163）和是否感染Hp，以探討Hp感染和TAMs與不同部位的Ⅲ期胃腺癌患者預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月—2014年12月就診于天津醫科大學腫瘤醫院胃部腫瘤科經病理確診為Ⅲ期胃腺癌的病理組織石蠟標本。其中男223例，女77例；年齡范圍27～83歲，平均（59.78±11.04）歲。分期采用最新的國際抗癌聯盟（International Union Against Cancer，UICC）和美國抗癌聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版TNM分期。納入標準：（1）年齡20～85歲。（2）無遠處轉移。（3）手術切緣鏡下陰性。（4）診斷確切。（5）臨床分期為Ⅲ期。（6）病例信息完備。排除標準：（1）術前接受除手術外的抗癌治療者。（2）合并第二原發性腫瘤者。（3）失訪者。共收集到符合要求的研究對象300例。其中胃底賁門癌100例、胃體癌100例和胃竇癌100例。本研究得到天津醫科大學腫瘤醫院倫理委員會批準，標本取材經家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 鼠源單克隆抗CD68抗體購于美國Thermo Fisher公司；兔源單克隆抗CD163抗體購于美國Abcam公司；鼠源單克隆抗CD66b抗體購于美國BioLegend公司；鼠源單克隆抗Hp抗體購于邁新生物技術開發有限公司；DAB顯色試劑盒購于北京中衫金橋生物有限公司；二抗即酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物購于邁新生物技術開發有限公司；生物顯微鏡（型號BX51TRF）購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 所有組織標本均經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，組織切片70℃烤箱烘烤1 h后，常規脫蠟，去離子水中浸泡復水15 min，用枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復3 min，自然晾至室溫，3%H2O2封閉30 min，PBS沖洗5 min×3遍，加入稀釋比例分別為CD68（1∶400）、CD163（1∶200）、CD66b（1∶100）、Hp（1∶100）于4℃冰箱孵育過夜。PBS洗5 min×3遍后，于室溫孵育二抗（即用型免疫組化Elivision plus試劑）30 min，經DAB顯色3～5 min，鏡下（100×）觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片。免疫組化陽性標準：根據染色強度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強陽性）。

1.3.2 免疫組化檢測結果判定 所有指標的結果均由2位病理主治醫師經雙盲法判定。CD68和CD163陽性細胞計數：低倍（100×）下觀察切片，選擇陽性細胞分布最高密度區即“熱點”，然后高倍（400×）下分別在癌巢（center of cancer tissues，CT）和癌巢浸潤邊緣（infiltrating edge of cancer nests，CI）計數5個視野的陽性細胞數，取其平均值為該例的CD68和CD163陽性細胞值，然后以中位數為截斷值，分為高表達組和低表達組。將CD68陽性細胞在胃腺癌癌巢浸潤邊緣數量多于癌巢者定義為Ⅰ型胃腺癌，反之為Ⅱ型胃腺癌。CD66b陽性細胞計數：低倍（10×）下觀察切片，選擇中性粒細胞陽性細胞分布最高密度區，然后高倍（400×）下計數5個視野的陽性細胞數，取其平均值。然后以中位數為截斷值，分為高表達組和低表達組。Hp結果判定：高倍（400×）下觀察胃黏膜表面上皮與黏膜層之間和胃小凹，若觀察到粗桿狀、海鷗狀菌體，部分呈顆粒和團塊狀，染色無棕黃色，則為陰性。

1.3.3 觀察指標 計算患者CD68、CD163和CD66b陽性細胞數和Hp菌體數，觀察其表達水平與臨床病理特征的相關性以及與無病生存期（disease-free survival，DFS）、總生存期（overall survival，OS）的關系。

1.3.4 隨訪 隨訪開始于手術日，截止于2019年12月31日，以電話聯系及定期復診形式進行，中位隨訪時間為48個月，隨訪內容包括患者體重、精神狀態、飲食、大小便的變化等。其中DFS定義為從手術日期到腫瘤復發或者是到最后1次隨訪的間隔時間。OS是指從手術日期到患者因腫瘤死亡或者到最后1次隨訪的間隔時間。

1.4 統計學處理 采用SPSS20.0、GraphPad Prism8進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布則以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關。繪制Kaplan-Meier生存曲線，截斷值為中位數，采用Log-rank法比較生存率。Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料300例胃腺癌患者按照發病部位分為3組，3組的性別、年齡、癌胚抗原（CEA）、體重指數（BMI）、吸煙和淋巴結轉移差異均無統計學意義。與胃體癌組比較，胃竇癌組飲酒者較多（t=6.742，P<0.05）；與胃底賁門癌組比較，胃竇癌組和胃體癌組腫瘤較小（χ2=5.972，P<0.05），見表1。

表1 3組患者一般資料比較[n(%），±s，M（IQR）]Tab 1 Comparison of basic characteristics among the three groups[n(%），±s，M（IQR）]

注：與胃底賁門癌組比較，aP＜0.05;與胃體癌組比較，bP＜0.05；CEA：癌胚抗原；BMI：體重指數

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2.2 CD68+TAMs和CD163+TAMs在不同部位胃腺癌組織中的表達情況CD68蛋白在巨噬細胞胞漿和胞膜呈陽性表達，呈棕褐色（圖1）。CD163蛋白在M2型巨噬細胞胞漿和胞膜呈陽性表達，呈棕褐色（圖2）。3個部位胃腺癌的TAMs空間分布不同，多在胃底賁門癌和胃體癌的癌巢浸潤邊緣和胃竇癌的癌巢分布。

2.3 CD68+TAMs和CD163+TAMs在不同部位胃腺癌組織中表達水平比較CD68+和CD163+TAMs在胃竇癌癌巢的相對表達水平高于癌巢浸潤邊緣；在胃底賁門癌癌巢浸潤邊緣的相對表達水平高于癌巢；在胃體癌癌巢浸潤邊緣的相對表達水平高于癌巢，差異有統計學意義（均P<0.01），見表2。

表2 3組患者CD68和CD163蛋白的表達[M（P25，P75）]Tab 2 Expressions of CD68 and CD163 proteins in three groups[M（P25，P75）]

2.4 CD68+TAMs與預后的相關性300例患者隨訪期均為5年，隨訪率為100%。CD68+TAMs在胃底賁門癌癌巢的浸潤與預后呈正相關（rs=0.674，P=0.023），高計數組OS明顯長于低計數組，差異有統計學意義，其他兩個部位未見明顯差別，CD68+TAMs高計數組在3個部位癌巢的5年累計總生存率分別為52.6%、44.1%和54.3%，5年累計無病生存率分別為25.7%、39.4%和44.9%；低計數組在3個部位癌巢的5年累計總生存率分別為33.3%、39.4%和36.7%，5年累計無病生存率分別為25.7%、29.6%和36.7%，見圖3。CD68+TAMs在3個部位胃腺癌癌巢浸潤邊緣的浸潤與預后呈負相關，低計數組OS均明顯長于高計數組，在胃體癌癌巢浸潤邊緣低計數組DFS長于高計數組，差異有統計學意義，其他兩個部位未見明顯差異，CD68+TAMs高計數組在3個部位癌巢浸潤邊緣的5年累計總生存率分別為26.3%、34.7%和28.8%，5年累計無病生存率分別為25.0%、25.0%和34.6%；低計數組在3個部位癌巢的5年累計總生存率分別為55.6%、48.7%和45.1%，5年累計無病生存率分別為32.5%、42.5%和47.1%，見圖4。

圖3 不同部位胃腺癌癌巢的CD68蛋白表達與預后的關系Fig 3 Relationship between expression of CD68 protein in gastric adenocarcinoma nests at various sites and prognosis

圖4 不同部位胃腺癌癌巢浸潤邊緣的CD68蛋白表達與預后的關系Fig 4 Relationship between expression of CD68 protein at the edge of gastric adenocarcinoma nest at the various sites and prognosis

2.5 CD163+TAMs與預后的相關性CD163+TAMs在胃體癌癌巢的浸潤與預后呈正相關，高計數組DFS明顯好于低計數組，差異有統計學意義，其他兩個部位未見明顯差別，CD163+TAMs高計數組在3個部位癌巢的5年累計總生存率分別為39.0%、42.1%和49.7%，5年累計無病生存率分別為31.1%、41.9%和43.5%；低計數組在3個部位癌巢的5年累計總生存率分別為34.7%、42.1%和33.1%，5年累計無病生存率分別為23.1%、26.1%和37.8%，見圖5。CD163+TAMs在3個部位胃腺癌癌巢浸潤邊緣的浸潤與預后呈負相關，低計數組OS均明顯好于高計數組，在胃竇癌癌巢浸潤邊緣低計數組DFS好于高計數組，差異有統計學意義，其他兩個部位未見明顯差異，CD163+TAMs高計數組在3個部位癌巢浸潤邊緣的5年累計總生存率分別為20.4%、36.0%和33.1%，5年累計無病生存率分別為15.1%、23.2%和38.6%；低計數組在3個部位癌巢浸潤邊緣的5年累計總生存率分別為52.9%、48.0%和51.5%，5年累計無病生存率分別為41.2%、43.7%和44.2%，見圖6。

圖5 不同部位胃腺癌癌巢的CD163蛋白表達與預后的關系Fig 5 Relationship between expression of CD163 protein in gastric adenocarcinoma nest at various sites and prognosis

圖6 不同部位胃腺癌癌巢浸潤邊緣的CD163蛋白表達與預后的關系Fig 6 Relationship between expression of CD163 protein at the edge of gastric adenocarcinoma nest at the various sites and prognosis

2.6 驗證Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌與預后的相關性 不同部位的Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌的構成比例，見圖7。Ⅱ型胃腺癌累計OS和DFS率明顯高于Ⅰ型，差異有統計學意義，見圖8。

圖7 不同部位Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌構成比例Fig 7 Proportion of typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma atvarious sites

圖8 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者生存曲線Fig 8 Survival curves of patients with typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma

2.7 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者Hp的分布情況和CD66b蛋白的表達Hp主要分布在胃黏膜表面上皮與黏膜層之間，貼近黏膜表面上皮細胞，可進入癌巢，胃小凹和黏膜淺層腺腔內亦可見Hp，免疫組化染色呈棕褐色，粗桿狀、海鷗狀，部分呈顆粒和團塊狀。CD66b陽性細胞染色呈棕褐色，多分布在癌巢間質，癌巢內也可見（圖9）。Ⅰ型較Ⅱ型胃腺癌患者Hp陽性表達率低，差異有統計學意義（表3）。2.8Ⅰ型和Ⅱ型Hp陽性胃腺癌患者臨床病理特點的分析 Ⅰ型胃腺癌患者Hp陽性率與發生部位有關，胃底賁門和胃體部陽性率更高（χ2=6.352，P<0.05），而與性別、年齡、BMI、有無吸煙飲酒、腫瘤大小、CEA、淋巴結轉移無關；Ⅱ型胃腺癌患者Hp的陽性率在不飲酒者中更高（χ2=4.996，P<0.05），而與發生部位、性別、年齡、BMI、有無吸煙、腫瘤大小、CEA和淋巴結轉移無關，見表4。

表3 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者Hp的陽性表達率[n(%)]Tab 3 Hp positive rateof patients with typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma[n(%)]

表4 Ⅰ型和Ⅱ型胃腺癌患者Hp陽性表達率與臨床病理特點的關系[n(%)]Tab 4 The relationship between the positive rate of Hp and clinical parameters of patients with typeⅠand typeⅡgastric adenocarcinoma[n(%)]

2.9 Ⅰ型和Ⅱ型不同部位的Hp陽性胃腺癌患者與預后的相關性 腫瘤大小與年齡、發生部位有關系；分型與發生部位、中性粒細胞顯著相關；Hp與發生部位、分型有關，見表5。單因素分析顯示，在不同性別、年齡是否大于50歲、不同BMI、有無吸煙飲酒史、不同CEA、淋巴結是否轉移、中性粒細胞不同水平間中位DFS差異無統計學，而發生部位在胃體和胃竇部、腫瘤直徑＜4 cm、Ⅱ型、Hp陽性者中位DFS較長，生存質量較好（P＜0.05）；在發生部位、不同性別、年齡是否大于50歲、不同BMI、有無吸煙飲酒史、不同CEA間中位OS差異無統計學意義，而腫瘤直徑＜4 cm、無淋巴結轉移、Ⅱ型、Hp陽性、中性粒細胞高水平者的中位OS較長，生存質量較好（P＜0.05），見表6。多因素分析顯示腫瘤大小、分型、Hp和中性粒細胞水平是胃腺癌的獨立預后因素（P＜0.05），見表7。Ⅱ型Hp陽性胃體癌和胃竇癌患者的5年累積總生存率和無病生存率明顯高于Ⅰ型Hp陰性（P＜0.05），見圖10。

表5 各臨床病理特征之間的相關性(r)Tab 5 Correlation between each clinical parameters(r)

表6 300例胃腺癌患者生存資料單因素分析Tab 6 Univariate analysis of prognosis factors in 300 patients with gastric adenocarcinoma

表7 300例胃腺癌患者生存資料的多因素分析Tab 7 Multivariate analysis of prognosis factors in 300 patients with gastric adenocarcinoma

注：OS：總生存期；DFS：無病生存期

3 討論

宿主遭受損傷、炎癥、感染和惡性腫瘤時，單核細胞從血液循環中招募出來，分化為組織巨噬細胞[10]。既往研究表明，CD68和CD163蛋白是最常見的TAMs標志物[11]。CD68作為泛巨噬細胞，CD163作為M2型巨噬細胞標志物，常被用于TAMs的評估和分類。但CD68＋和CD163＋TAMs在腫瘤微環境中的意義仍存在爭議。CD68＋和CD163＋TAMs的浸潤與食管癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌以及卵巢癌患者預后不良有關[12-16]。本研究行免疫組化染色示CD68＋和CD163＋TAMs在不同部位胃腺癌的表達并進行生存分析，發現CD68＋和CD163＋TAMs多在胃底賁門癌、胃體癌癌巢浸潤邊緣和胃竇癌癌巢表達，且它們在不同部位胃腺癌癌巢浸潤邊緣的表達水平與預后呈負相關，與上述研究結果一致。還發現各部位的Ⅱ型胃腺癌患者預后普遍好于Ⅰ型，上述結論得到驗證。CD68＋和CD163＋TAMs在胃腺癌癌巢的高表達與預后呈正相關，雖然這一結果沒有達到統計學差異，但可能預示著TAMs只有進入癌巢才能更好發揮吞噬腫瘤細胞的作用，今后需要擴大納入病例對預后進行深入研究。

本研究結果顯示Ⅱ型胃腺癌里胃竇癌占87%，猜想可能是Hp引起的這種現象，Hp破壞線粒體轉錄基因的調控，影響胃黏膜上皮細胞癌基因的轉錄平衡，但對T淋巴細胞的免疫平衡無影響。Hp定植于人的胃黏膜表面，機體對細菌產生免疫反應，導致免疫或炎癥組織損傷。因此，人體內的免疫系統通過細菌與上皮的黏附而被激活，從而有效地將Hp抗原呈遞給T細胞和B細胞，進而產生針對Hp的特異性細胞和體液免疫[17]。正常情況下，人體內的免疫系統具有完善的免疫監視功能。其中，抗原提呈細胞可識別、捕獲、加工和呈遞內源和外源抗原，誘導機體產生特異性的抗腫瘤和抗炎免疫反應，同時具有免疫調節功能。此外，還受到局部巨噬細胞、細胞因子和內毒素的影響和調節，與消化道炎癥和腫瘤密切相關。這些結果表明，上述免疫功能改變在胃癌的發生、發展中起重要作用，但其潛在機制尚需進一步研究。

既往研究認為Hp感染可能會加速胃癌的進展[18]。筆者行免疫組化法染色Hp菌體并計數，發現Ⅱ型胃腺癌Hp陽性表達率高于Ⅰ型（P=0.039），單因素回歸分析發現Hp陽性患者中位OS、DFS長于陰性且胃體癌和胃竇癌Ⅱ型胃腺癌Hp陽性患者預后最好，提示Hp感染可能通過影響TAMs浸潤癌巢來改善腫瘤發展，此結果與杜金耀[9]不同，原因可能是本研究區分不同部位且嚴格控制同一臨床分期，避免出現由于早期、晚期患者數量不均和不同部位胃腺癌患者預后本身存在差異。另外，胃底賁門癌的Ⅱ型患者太少無法進行預后分析，后期需要進一步擴大樣本。

本研究還發現Ⅰ型胃腺癌患者感染Hp的數量與發生部位有關，胃底賁門和胃體部陽性率更高，可能原因：Ⅰ型胃竇癌為少數；Hp定植部位上移。Ⅱ型胃腺癌患者Hp的陽性表達率在不飲酒者中更高（P<0.05），是因為酒精有抵抗Hp的作用[19]。單因素回歸分析發現腫瘤體積較小，中位OS、DFS較長，因為腫瘤體積的增加會壓迫周圍血管、神經，繼而誘發其他病變，影響患者的生存時間。中性粒細胞高水平者的中位OS較長，這一結論與Zhang等[20]的觀點一致。本研究發現Ⅱ型Hp陽性胃體癌和胃竇癌患者的生存時間明顯高于Ⅰ型Hp陰性，推測可能是胃內Hp的感染促進TAMs向癌巢內浸潤進而殺傷腫瘤細胞。

總之，本研究提示了腫瘤大小、TAMs的浸潤分型和Hp是否感染可能是Ⅲ期胃腺癌的獨立預后因素，不同部位的Ⅱ型胃腺癌的Hp感染可能促進TAMs的癌巢浸潤，抑制腫瘤的發展速度，緩解患者的生存壓力，但是具體機制需要后期更加深入的基礎研究和臨床研究來探討Hp和TAMs之間的關系，為胃腺癌的治療提供新的思路。