橘子不同部位活性成分含量及其體外抗氧化能力研究

劉仙俊，李文華*，孫紅艷，尤金美，張紅陽，張天宇，郝春燕，衛樂

（1.太原科技大學化學與生物工程學院，山西 太原 030024；2.山東省臨沂市第十八中學，山東 臨沂 276000）

橘子，蕓香科柑橘屬（Citrus reticulata Blanco）植物[1]，不僅具有豐富的營養價值更具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗炎、保護神經、預防糖尿病和心血管疾病等重要的醫學價值[2-3]。橘肉香氣清爽，口感酸甜，富含營養成分，是人們的常食部位，橘皮、橘絡具有化痰止咳、健脾和胃、順氣活血的功效，經常入藥使用[3-5]。橘子各部位的營養價值和其富含多酚類、黃酮類、多糖、礦物質、維生素等生物活性物質是分不開的[2，6-10]，這些天然活性物質大多具有抗氧化的作用，能夠清除人體內多余的自由基，使機體免受活性氧自由基傷害而導致的蛋白質和核酸受損、酶失活、脂質過氧化等不良后果[11-21]。目前對橘子生物活性物質的研究主要集中在橘皮，孫紅彥[3]研究表明橘子皮提取物可以保護機體免疫器官、提高機體免疫水平、抑制體內實體瘤的生長從而實現抗腫瘤作用；劉存芳等[5]研究發現橘皮多糖對羥基自由基具有較強的清除作用且存在一定量效關系，但對橘皮、橘肉和橘絡的生物活性成分含量及其抗氧化性的比較研究很少有報道。

本文以橘皮、橘肉、橘絡作為研究對象，分別對其總酚、總黃酮和多糖含量及體外抗氧化性能進行檢測和比較分析，旨在為橘皮、橘肉、橘絡的深加工提供充足的參考依據，為橘子各部位相關產品在抗氧化功效方面的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘子：市售，臨海涌泉蜜橘，新鮮優質且無壞果。

沒食子酸、蘆丁、葡萄糖（均為色譜純）：美國Sigma公司；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、七水硫酸亞鐵（均為分析純）：上海生工生物工程股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、正丁醇、乙醚、氯仿、抗壞血酸、水楊酸、濃鹽酸、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

臺式離心機（D-37520型）：德國賽默飛世爾科技公司；紫外可見分光光度計（UV-5200型）：上海元析儀器有限公司；高速萬能粉碎機（FW-200型）、電熱恒溫水浴鍋（HH-2A型）：北京科偉永興儀器有限公司；電子分析天平（FA1004型）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；酸度計（PHS-3C型）：上海佑科儀器儀表有限公司；真空冷凍干燥箱（Pilot5-8M型）：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理及樣品溶液制備

將橘子去灰洗凈，分離出橘皮、橘肉、橘絡，分別切碎后擺在凍干盤內真空冷凍干燥，粉碎后過篩（60目）備用。稱取2 g凍干粉末樣品，加入70%的乙醇溶液，使料液比達到 1∶10(g/mL)，60℃下，以 250 r/min振蕩2 h后，7 000 r/min離心10 min，緩慢吸取上清液，剩余殘渣在同等條件下再提一次，兩次上清液合并且定容備用，所有試驗重復3次。

1.3.2 測定橘子不同部位的總酚含量

1.3.2.1 繪制沒食子酸標準曲線

沒食子酸標準曲線見圖1，得到具有良好線性關系的回歸方程：Y=106.25X+0.0243，回歸系數R2=0.9909（X為沒食子酸標液濃度，mg/mL；Y為吸光度）[22]。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

1.3.2.2 測定總酚含量

取25 mL容量瓶，加入樣品溶液1 mL、Na2CO3溶液（質量分數12%）2 mL、福林酚1 mL，定容至刻度，避光反應2 h，測765 nm處吸光度，根據公式（1）計算橘皮、橘肉、橘絡的總酚含量。

式中：P為樣品總酚含量，mg/g；C為經標準曲線計算得出的反應液總酚濃度，mg/mL；V為反應液體積，mL；N為稀釋倍數；M為樣品干重，g。

1.3.3 測定橘子不同部位的總黃酮含量

1.3.3.1 繪制蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線見圖2，得到線性關系良好的回歸方程：Y=10.602X+0.015 9，回歸系數 R2=0.994 9（X 為蘆丁標液濃度，mg/mL；Y 為吸光度）[9]。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 The standard curve of rutin

1.3.3.2 測定總黃酮含量

取10 mL容量瓶，加入樣品液2.0 mL、70%的乙醇3 mL、質量濃度5%的NaNO2溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min后，取質量濃度10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL加入其中，混勻，再靜置6 min；取4%的NaOH溶液（質量濃度）4 mL加入其中，最后用70%的乙醇定容到10 mL，混勻，12 min靜置結束后立即測510 nm處吸光度，根據公式（2）計算橘皮、橘肉、橘絡的總黃酮含量。

式中：P為樣品總黃酮含量，mg/g；C為經標準曲線計算得出的反應液總黃酮濃度，mg/mL；V為反應液體積，mL；N為稀釋倍數；M為樣品干重，g。

1.3.4 測定橘子不同部位的多糖含量

1.3.4.1 繪制葡萄糖標準曲線

參照文獻[22]，繪制苯酚-硫酸法測樣品多糖含量所用的葡萄糖標準曲線，如圖3所示。得到線性關系良好的回歸方程：Y=73.103X+0.032 1，回歸系數R2=0.994（X為葡萄糖濃度，mg/mL；Y為吸光度）。

圖3 葡萄糖標準曲線Fig.3 The standard curve of glucose

1.3.4.2 測定多糖含量

準確稱取樣品凍干粉末300 mg于10 mL離心管，加蒸餾水定容至10 mL，混勻后水浴（85℃）并振蕩2 h，8 000 r/min離心10 min，轉移上清液至另一潔凈離心管，加 10 mL 的 Sevage試劑[正丁醇:氯仿=1∶4（體積比）]，振蕩 5 min，8 000 r/min 離心 10 min，將水相轉移到3倍體積80%的乙醇中，搖勻，靜置2 h后離心15 min（5 000 r/min），所得沉淀干燥即為粗多糖，其用蒸餾水溶解定容到25 mL，吸取1 mL定容液，按參考文獻[23]測吸光度，根據公式（3）計算橘皮、橘肉、橘絡的多糖含量（以葡萄糖計）。

式中：P為樣品多糖含量，mg/g；C為經標準曲線計算得出的反應液多糖濃度，mg/mL；V為反應液體積，mL；N為稀釋倍數；M為樣品干重，g。

1.3.5 測定DPPH自由基（DPPH·）清除率

取3支潔凈試管，分別準確吸取0.5 mL樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），然后分別加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL，輕輕混勻后于37℃避光反應30 min，冷卻至室溫（25℃），測515 nm處吸光度，根據公式（4）計算橘子不同部位的DPPH·清除率。

式中：Ai為樣品吸光度；Aj為陽性對照吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.6 測定超氧陰離子自由基（O2-·）清除率

3支空試管中分別移取0.5 mL樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），再分別加入4.0 mL的Tris-HCl緩沖液（0.2 mol/L，pH 8.2），混勻，靜置4 min，加入2滴8 mol/L鹽酸立即終止反應，測420 nm處吸光度，根據公式（4）計算樣品的O2-·清除率。

1.3.7 測定羥基自由基（·OH）清除率

取3支空試管，分別準確移取0.5 mL的樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），再分別加入2 mmol/L的水楊酸0.4 mL、6 mmol/L的 H2O2溶液 1 mL、0.15 mmol/L的 FeSO4溶液 1 mL及蒸餾水0.4 mL，混勻，37℃下水浴1 h，冷卻至室溫（25℃）后于510 nm處測吸光度，根據公式（4）計算樣品的·OH清除率。

1.3.8 測定過氧化氫（H2O2）清除率

向3支空試管中各吸取3.4 mL樣品溶液（樣品組）、抗壞血酸溶液（陽性對照組）和蒸餾水（空白組），再分別加入40 mmol/L的H2O2溶液（用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制）0.6 mL，混勻，測230 nm處吸光度，根據公式（4）計算樣品H2O2清除率。

1.4 統計分析

試驗均重復3次，數值以平均值±標準差表示，采用統計學軟件SPSS17.0進行相關性、顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 橘子不同部位的活性成分含量

分別對橘皮、橘肉、橘絡中的總酚、總黃酮和多糖含量進行了測定，結果見表1。

表1 橘子不同部位中活性成分含量Table 1 The contents of active components in different parts of tangerine

如表1所示，橘子不同部位各活性成分含量均存在顯著差異（P＜0.05）。橘皮、橘肉、橘絡中總酚含量最高的是橘肉，為（10.51±0.36）mg/g，其次是橘皮，橘絡總酚含量最低，為（6.38±0.27）mg/g。橘子不同部位的總黃酮含量也有顯著差異，在（1.54±0.05）mg/g～（6.13±0.23）mg/g的范圍內，其總黃酮含量最高是橘皮，為（6.13±0.23）mg/g，其次是橘肉，橘絡總黃酮含量最低。從表1可以看出，橘子不同部位的總黃酮含量都低于其總酚含量，這可能是由于大多數的黃酮類化合物都屬于多酚類物質。橘皮、橘肉、橘絡中的多糖含量在（18.05±0.24）mg/g～（36.40±0.11）mg/g 的范圍內，其中橘皮多糖含量最高，為（36.40±0.11）mg/g，其次是橘肉，橘絡多糖含量最低。橘子不同部位的多糖含量都高于其總酚和總黃酮含量，橘皮和橘肉的總酚、總黃酮和多糖含量都高于橘絡。

2.2 橘子不同部位抗氧化能力比較

各種抗氧化成分具有不同的抗氧化機理[24-25]，且橘子各部位的活性成分及含量也具有差異，所以需要綜合不同的檢測方法分析其抗氧化能力，本研究通過對 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2的清除率來分析橘子不同部位的抗氧化能力，具體結果見表2。

表2 橘子不同部位的自由基清除率Table 2 Free radical scavenging rate of different parts in tangerine

由表2可知，橘子不同部位對4種自由基的清除率均存在明顯差異，這可能是由于橘子不同部位所含的抗氧化活性成分及含量不同。

DPPH·是一種穩定性較好的自由基，被廣泛用于天然活性物質的抗氧化能力研究[26]，由表2可見，橘皮、橘肉、橘絡的DPPH·清除率存在顯著差異（P＜0.05），其中橘皮DPPH·清除率最高，為（82.99±0.91）%，其次是橘肉和橘絡，DPPH·清除率分別為（76.60±0.73）%和（56.90±1.26）%。

O2-·是一種性質活潑的自由基，可致衰老、機體脂質過氧化、細胞損傷，并誘發多種皮膚病、心血管疾病和癌癥等[25]，從表2可以看出，橘皮、橘肉、橘絡的O2-·清除率也有顯著差異（P＜0.05），但相比其它3種自由基的清除率來說相對較低，其中O2-·清除率最高是橘肉，為（58.27±0.98）%，其次是橘皮和橘絡，O2-·清除率分別為（49.83±0.82）%和（36.34±0.47）%。

·OH是一種氧化性極強的自由基，具有強大的得電子能力，使其對生物體有強毒害，常導致人體產生各種復雜疾病[25]。如表2所示，橘子不同部位·OH清除率具有一定差異，其中清除率最高的為橘肉，高達（89.83±0.96）%，其次是橘皮和橘絡，二者之間的·OH清除率差異不顯著（P＞0.05），分別為（70.00±1.62）%和（69.58±1.12）%。

H2O2也是造成人體疾病和衰老的重要原因之一，雖然從結構看并不同于一般自由基，但其對人體的傷害與自由基類似，主要損害人體內生物大分子[25]。由表2可以看出，橘皮、橘肉、橘絡的H2O2清除率差異顯著（P＜0.05），其中橘皮的H2O2清除率最高，為（69.61±0.75）%，其次是橘肉，H2O2清除率為（63.27±0.45）%，清除率最低的是橘絡，為（46.72±0.61）%。

2.3 橘子不同部位活性成分含量與抗氧化能力之間的相關性

通過SPSS 17.0統計軟件對橘子不同部位活性成分含量及其 DPPH·、O2-·、·OH 和 H2O2清除率之間進行相關性分析，所得各變量間的Pearson相關系數以及顯著性（雙側）檢驗結果如表3所示。

表3 橘子不同部位活性成分含量與其抗氧化活性之間的相關性Table 3 The coefficients among the contents of active components and antioxidant capacity of different parts in tangerine

從表3可以看出，橘子不同部位的總酚、總黃酮和多糖含量之間都呈現正相關，其中多糖含量和總酚、總黃酮含量間的相關性都較高（相關系數分別為0.698和 0.933）；橘子各部位總酚含量與 DPPH·、O2-·、·OH和H2O24種自由基清除率都呈正相關，其中與O2-·清除率相關性顯著（P＜0.05，相關系數為0.999）；總黃酮含量與DPPH·、O2-·和H2O23種自由基清除率呈正相關（相關系數分別為0.883、0.438和0.899）；橘子不同部位多糖含量與4種自由基清除率之間也都呈正相關，其中與DPPH·和H2O2清除率相關性較高（相關系數分別為0.993和0.996）；橘子4種自由基清除率之間都呈正相關，其中DPPH·和H2O2清除率相關性顯著（P＜0.05，相關系數為 0.999）。

3 結論

橘子不同部位的總酚、總黃酮和多糖含量均存在顯著差異（P＜0.05），其中總酚含量以橘肉為最高，為（10.51±0.36）mg/g，橘皮中總黃酮和多糖含量均最高，分別為（6.13±0.23）mg/g 和（36.40±0.11）mg/g，橘子各部位的多糖含量都高于其總酚含量，其總酚含量都高于其總黃酮含量，橘皮和橘肉的總酚、總黃酮和多糖含量都高于橘絡。

橘子不同部位清除各種自由基的能力都比較強，但也存在明顯差異，其中橘皮對DPPH·和H2O2清除率最高，分別為（82.99±0.91）%和（69.61±0.75）%，橘肉對O2-·和·OH清除率最高，分別為（58.27±0.98）%和（89.83±0.96）%。橘皮和橘肉對4種自由基清除率都高于橘絡。

相關性分析表明橘子不同部位的總酚含量、總黃酮含量及多糖含量之間都呈正相關，且橘子總酚含量、多糖含量與4種自由基清除率之間也都呈正相關，其O2-·清除率與總酚含量間呈顯著正相關（P＜0.05，相關系數為0.999），總黃酮含量與DPPH·、O2-·和H2O2這3種自由基清除率之間也呈正相關。

總之，橘皮、橘肉和橘絡中都含有豐富的多酚、黃酮和多糖類物質，且具有比較強的抗氧化能力，該研究可為橘子不同部位的深加工及天然抗氧化產品的開發提供理論參考。