哈密地區奶疙瘩微生物多樣性研究

張苗苗，蔡文超，旦巴達貢，單春會，李寶坤，肖石高，郭壯*

（1.湖北文理學院湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；3.湖北澳利龍食品股份有限公司，湖北 宜昌 444100）

發酵乳制品是原料乳經微生物自然發酵，通過不同的加工方式制作而成，包括酸馬奶、奶酪、乳酒、酥油和馬奶酒等[1]。發酵乳制品中微生物類群較為豐富，賦予了產品獨特的風味，因而對發酵乳制品中微生物的群落結構進行解析是極為必要的。張冬蕾[2]對新疆地區昭蘇縣和特克斯縣酸牛奶樣品中的微生物進行研究發現，優勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes），優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）；優勢細菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），優勢真菌屬為釀酒酵母屬（Saccharomyces）。ALEJANDRO等[3]對墨西哥塔巴斯科州的牛奶、發酵乳清、凝乳和成熟奶酪的細菌進行分析發現，在原料奶中主要為大球菌屬（Macrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和水桿菌屬（Hydrobacillus）；乳清、凝乳和奶酪中主要為Streptococcus和Lactobacillus。SESSOU等[4]對貝寧和尼日爾地區的Wagashi奶酪和發酵牛奶進行研究同樣發現，馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces Max）和Saccharomyces是主要酵母菌種。由此可見，不同地區生產的發酵乳制品微生物群落結構存在較大的差異。

奶疙瘩是新疆哈薩克族居民經常食用的一種傳統乳制品，其生產工藝和濃縮型酸奶或酸奶干酪類似[5]。奶疙瘩的制作多采用手工生產，將自然發酵的牛（羊）奶去水后自然干燥而成[6]。然而目前關于奶疙瘩的研究一般集中在生產工藝[7]、風味組成[8]以及乳酸菌的分離[9]等方面，而對其微生物群落結構的研究較少。高通量測序技術具有準確性高、測序深度廣和樣本測序量大的優點[10]，目前在酸奶[11]、酸馬奶[12]、駝奶[13]和奶酪[14]等發酵乳制品中均有了一定的應用。新疆維吾爾自治區哈密地區，居住的少數民族眾多，主要有維吾爾族、哈薩克族、回族、蒙古族以及滿族等，是絲綢之路的咽喉，屬典型的溫帶大陸性干旱氣候，為全國日照時數最多的地區之一[15]。

本研究采用第二代高通量測序技術，對采集自新疆維吾爾自治區哈密地區的4份奶疙瘩樣品中的真菌和細菌的群落結構進行了解析，以期為后續奶疙瘩的工業化生產以及優良菌種的篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物SSU0817F/SSU1196R、338F/806R：天一輝遠生物科技有限公司合成；DNA 聚合酶、dNTPs mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液：北京全式金生物技術有限公司。

VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀：美國AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo Fisher公司；CR21N高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；Fluor Chem FC3型化學發光凝膠成像系統：美國ProteinSimple公司；MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務器：美國DELL公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集

奶疙瘩樣品采自新疆維吾爾自治區哈密地區伊州區、伊吾縣和巴里坤哈薩克自治縣牧區，共采集了4份，編號分別為H1～H4。在進行細菌和真菌多樣性分析時為便于區分，HB1為H1樣品的細菌編號，而HF1為H1樣品的真菌編號，其他樣品編號規則一致。

1.2.2 樣品微生物宏基因組DNA提取、PCR擴增及高通量測序

在使用試劑盒對奶疙瘩樣品中微生物宏基因組DNA提取的基礎上，進行核苷酸序列的PCR擴增。參照董蘊等[16]和周書楠等[17]的方法，對細菌16S rRNAV3-V4區和真菌18SrRNAV4-V5區進行PCR擴增。PCR產物郵寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司，使用MiSeq PE300高通量測序平臺進行高通量測序。

1.2.3 生物信息學分析

參照李娜等[18]的方法，將序列進行拼接，然后對拼接好的序列進行質控和篩選。使用QIIME分析平臺[19]對微生物多樣性進行分析，使用PyNAST將質檢合格的序列對齊[20]，使用UCLUST劃分得到各分類操作單元 （operational taxonomic units，OTU）[21]，繼而 使用Greengenes[22]和 RDP（ribosomal database project，Release 11.5）[23]數據庫以及SILVA[24]數據庫分別對細菌和真菌的OTU代表性序列進行同源性比對，然后對Chao1指數、Simpson指數和Shannon指數3個Alpha多樣性指標進行分析，最后對優勢細菌屬和優勢真菌屬的相關性進行研究。本研究將存在于所有樣品的OTU定義為核心OTU，將樣品中平均相對含量大于1.0%細菌或真菌的門或屬定義為優勢門或屬。

1.3 數據處理

本研究使用Office 2016繪制瀑布圖，使用Origin 2017繪制柱狀圖和散點圖，使用R軟件（v4.2.0）的UpSetR、Waterfall和Corrplot軟件包繪制其他圖。

2 結果與分析

2.1 奶疙瘩中細菌和真菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數可以用來反映樣品中菌群的多樣性，本研究選取Chao1、Simpson和Shannon 3個常用指數來分析奶疙瘩樣品中的微生物多樣性。Chao1指數與群落的豐富度呈正相關；Shannon指數與Simpson指數呈負相關，Shannon指數越高表示群落多樣性越大，而Simpson指數越高表示群落多樣性越小[25]。樣品Alpha多樣性指數見表1。

表1 樣品Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of samples

如表1所示，通過比較Chao1指數可知，HB2樣品中細菌的群落豐富度最大，Chao1指數為798，而HF3樣品中真菌群落豐富度最大，其Chao1指數為2 969。通過比較Shannon指數可知，細菌多樣性HB1>HB4>HB2>HB3，真菌多樣性HF3>HF2>HF1>HF4。由表1還可知，不同奶疙瘩樣品間的微生物多樣性和豐富度存在較大差異，樣品中真菌的豐富度比細菌高但真菌的多樣性整體稍低于細菌。為進一步評估本研究的測序深度是否滿足后續要求，對Shannon指數的變化趨勢進行了研究，結果如圖1所示。

圖1 細菌和真菌的Shannon曲線Fig.1 Shannon curves of bacteria and fungi in samples

本研究中4個奶疙瘩樣品細菌和真菌的平均有效測序深度分別為41 587條序列和49 637條序列，由圖1可知，樣品細菌和真菌的Shannon曲線均在測序量約為5 000條時趨于平穩，表明本研究測序深度足夠，測序數據可滿足后續要求。

2.2 基于門和屬水平奶疙瘩中微生物群落結構分析

本研究對代表性序列進行同源性對比發現，4個奶疙瘩樣品中共鑒定出了24個細菌門和9個真菌門。基于門水平細菌和真菌相對含量的比較分析見圖2。

圖2 基于門水平細菌和真菌相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis of relative contents of bacteria and fungi at phylum level

如圖2所示，平均相對含量大于1.0%的細菌門有5個，分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria），平均相對含量分別為44.47%、41.63%、5.77%、3.24%和2.75%；核心真菌門有3個，主要隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota），平均相對含量分別為77.10%、11.74%和7.36%。滕香旭[26]對酸奶、嚼克和奶豆腐等內蒙傳統發酵乳制品中微生物多樣性進行研究發現，Firmicutes和Bacteroidetes為優勢細菌門，Ascomycota為優勢真菌門。劉楊柳[27]發現Proteobacteria和Firmicutes亦為新疆3個不同地區傳統發酵奶疙瘩中的優勢細菌門，雷炎等[28]發現新疆塔城地區奶豆腐中的優勢細菌門為Proteobac－teria、Frimicutes、Actinobacteria 和 Bacteroidetes，上述報道均與本研究相同。

在屬的分類水平上，共鑒定出426個細菌屬和57個真菌屬，其中細菌和真菌平均相對含量大于1.0%的優勢菌屬分別為14個和11個，其分布情況如圖3所示。

圖3 基于屬水平細菌和真菌相對含量的比較分析Fig.3 Comparative analysis of relative contents of bacteria and fungi at genus level

由圖3A可知，奶疙瘩樣品中優勢細菌屬和平均相對含量分別為乳桿菌屬（Lactobacillus，21.34%）、醋桿菌屬（Acetobacter，12.44%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，9.86%）、乳球菌屬（Lactococcus，9.06%）、鏈球菌屬（Streptococcus，6.64%）、羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia，5.20%）、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella，2.70%）、沙門氏菌屬（Salmonella，2.60%）、纖毛菌屬（Leptotrichia，2.27%）、腸球菌屬（Enterococcus，1.76%）、普雷沃氏菌屬（Prevotella，1.47%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia，1.43%）、放線菌屬（Actinomyces，1.41%） 和巨大球菌屬（Macrococcus，1.15%），Lactobacillus在樣品HB3中含量為80.84%，而在HB1、HB2和HB4中僅占0.88%、0.78%和2.86%，由此說明不同樣品間細菌多樣性存在差異。

由圖3B可知，優勢真菌屬及平均相對含量分別為畢赤酵母屬（Pichia，19.53%）、曲霉屬（Aspergillus，18.94%）、耐堿酵母屬（Galactomyces，15.87%）、巴克斯霉屬（Backusella，6.61%）、寡囊盤菌屬（Thelebolus，6.29%）、黑蔥花酵母屬（Filobasidium，6.21%）、德巴氏酵母屬（Debaryomyces，1.49%）、青霉屬（Penicillium，1.26%）、假絲酵母屬（Candida，1.19%）、絲孢酵母屬（Trichosporon，1.12%）和鹿茸屬（Cutaneotrichosporon，1.10%），但仍有13.70%的真菌無法鑒定到屬，間接說明奶疙瘩樣品含有豐富的真菌群落。

新疆地區乳制品種類繁多，包含酸牛奶、酸馬奶、酸駝奶、奶疙瘩和奶酪等多種傳統發酵食品，其中蘊含了豐富的微生物資源。XIE等[29]從新疆伊犁牧區的傳統發酵馬奶酒中分離得到了68株Lactobacillus。李偉程等[30]發現Lactobacillus為新疆伊犁牧區酸馬奶中的優勢細菌屬，Galactomyces為優勢真菌屬，李王強等[31]發現Pichia和孢圓酵母（Torulaspora）為新疆塔城地區奶酪中的優勢酵母，上述研究與本研究結果基本一致。

2.3 基于OTU水平奶疙瘩中微生物群落結構分析

OTU在樣品中的分布如圖4所示。

圖4 基于OTU的細菌和真菌UpSet分布圖Fig.4 OTU based UpSet diagram of bacteria and fungi in samples

由圖4A可知，樣品HB1～HB4中OTU總數為634、764、213、656個，核心OTU數為58個，占OTU總數的1.66%，但包含83790條序列，占總序列數的50.37%。由圖4B可知，樣品HF1～HF4中OTU總數為663、781、1 429、645個，核心OTU數僅為36個，占OTU總數的1.26%，但包含98 956條序列，占總序列數的49.84%。細菌和真菌中均有7個平均相對含量大于1.0%的核心OTU，其相對含量如圖5所示。

圖5 平均相對含量大于1.0%的細菌和真菌核心OTUFig.5 Core OTUs of bacteria and fungi with an average relative content greater than 1.0%in samples

由圖5A可知，細菌中核心OTU所包含序列數占總序列數的 50.37%，其中 OTU263、OTU965、OTU1694、OTU1750、OTU2433、OTU2949 和 OTU3240 分別隸屬于Lactococcus、Lactobacillus、Acetobacter、Ralstonia、Streptococcus、Escherichia/Shigella 和 Acinetobacter。由圖 5B可知，奶疙瘩中真菌核心優勢OTU所包含序列數占總序列數的 49.84%，其中 OTU25、OTU167、OTU744、OTU850、OTU1552、OTU2222 和 OTU2751 分別隸屬于Aspergillus、Debaryomyces、Digitaria、Backusella、Pichia、Filobasidium和未鑒定多毛霉菌綱（Dothidecomycetes）。由此可見，奶疙瘩中的核心細菌類群主要以Lactobacillus、Acetobacter、Acinetobacter 和 Lactococcus 為主，累計平均相對含量為47.27%，核心真菌群主要以Pichia、Aspergillus和Backusella為主。本研究通過分析發現奶疙瘩中還存在一定的Salmonella等常見的有害致病菌，可能引起病原菌感染、發熱和食物中毒[32]。

本研究進一步對奶疙瘩中優勢細菌屬和真菌屬之間的相關性進行了探究，如圖6所示。

圖6 細菌和真菌優勢菌屬的秩相關熱圖Fig.6 Rank correlation heat map of dominant genera of bacteria and fungi in samples

由圖 6可知，Galactomyces與 Streptococcus呈顯著負相關（P＜0.05，r=-0.924），與 Macrococcus與呈正相關（P＜0.05，r=0.966），與 Escherichia/Shigella呈極顯著 正 相 關 （P ＜0.001，r=0.999），Aspergillus 與 Leptotrichia、Prevotella和 Actinomyces均呈顯著正相關（P＜0.05）；Candida與 Enterococcus呈顯著正相關（P＜0.05，r=0.966）。由此可見，奶疙瘩中細菌和真菌類群可能存在一定的共生關系。

3 結論

哈密地區奶疙瘩中的細菌門主要為Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria，真菌門主要為 Ascomycota、Basidiomycota 和 Mucoromycota，細菌屬主要為 Lactobacillus、Acetobacter，真菌主要為 Pichia、Aspergillus和Galactomyces，奶疙瘩中細菌和真菌類群可能存在一定的共生關系。