水產品中的亞硝胺前處理方法優化及4種N-亞硝胺類化合物快速檢測

孫卓，楊程程，許宏虹，戰虎

（天津華測檢測認證有限公司，天津 300000）

隨著生活水平的提高，人們對飲食營養的要求日益增加。水產品中含有豐富的蛋白質、脂肪、人體必需氨基酸，因此水產品經過不同加工后成為餐桌上常見的美味佳肴。但是在進行腌制、油炸過程中，水產品營養物質會轉化成少量N-亞硝胺類化合物[1]，該物質是公認的具有較大毒害作用的污染物，也是已知的強致癌物之一，會對人體健康造成嚴重影響，過量攝入含有亞硝胺的食物后，人體會出現肝臟損傷，血小板破壞，乃至全身中毒[2]等表征。

隨著人們對亞硝胺的致癌機理[3]深入了解，對如何有效監管食品中的亞硝胺顯得尤為重要。GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》中規定水產動物[4]及其制品中N-二甲基亞硝胺[5]的限量值為4.0 μg/kg。GB 5009.26—2016《食品安全國家標準食品中N-亞硝胺類化合物的測定》中提供了兩種檢測方法。從儀器角度分析，氣相色譜-熱能分析法[6]由于儀器價格昂貴，不適用于一般實驗室。氣相色譜-質譜法，由于結果離子信息少，定性不準確等問題，容易產生N-二甲基亞硝胺假陽性的結果，而且很難消除樣品基質干擾。從前處理角度分析，水蒸氣蒸餾法[7]的試劑消耗量大，從提取到濃縮過程時間長，易造成目標化合物損失，回收率不穩定而且批量檢測存在一定的局限性。由于標準對N-二甲基亞硝胺限量要求低，因此傳統試驗儀器與前處理方法不能滿足水產品中N-二甲基亞硝胺檢測的準確度要求。相比之下，QuEChERS方法改進了樣品前處理方式，通過對樣品提取、凈化、直接進樣，利用基質分散萃取機理，進而達到吸附干擾物，保留目標物與凈化樣品的目的。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

扇貝柱、鮮蝦滑、巴沙魚片、墨魚丸：市售。

4種N-亞硝胺類化合物標準儲備液[N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亞硝基二丙胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基正丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA），純度均大于 98.0%，質量濃度均為100 mg/L]：安譜實驗科技股份有限公司；QuEChERS凈化填料除脂分散凈化包、除脂萃取鹽包：美國安捷倫公司；乙腈、正己烷（色譜純）：美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器

8860-5977型氣相色譜-串聯質譜儀（配電子轟擊離子源）：美國安捷倫公司；Vortex Genius 3型漩渦振蕩器：德國IKA公司；MGS-2200G型氮吹儀、RV10型旋轉蒸發儀：日本東京理化公司；KQ-500DV型超聲波清洗器：昆山舒美有限公司。

1.3 標準曲線繪制

取亞硝胺類化合物混合標準儲備液，用正己烷稀釋并配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準工作液，放于棕色儲液瓶，在-18℃冰箱保存。臨用時，移取上述配制好的工作液，用正己烷配制成濃度分別為1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的標準溶液，現用現配，繪制標準曲線。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取10 g（精確到0.000 1 g）水產樣品，放進50 mL離心管，加入20 mL正己烷，在室溫（35℃以下）以5 000 r/min的轉速離心5 min，樣品殘渣再用10 mL正己烷重復提取3遍，合并正己烷提取液于100 mL離心管中，使用渦旋振蕩器振蕩1 min，在室溫（35℃以下）用速率為5 000 r/min的離心機離心3 min，棄去正己烷層，重復兩次，然后轉移到容量瓶中進行定容，等待凈化。

1.4.2 凈化

使用移液器量取試樣1.5 mL待凈化溶液，置于含N-丙基乙二胺混合吸附劑50 mg、硅膠吸附劑150 mg以及無水硫酸鎂100 mg的2 mL離心管中，使用漩渦振蕩器振蕩30 s，使試樣混勻，放入轉速為12 000 r/min的離心機離心3 min，取上清液待氣相色譜-串聯質譜儀測定使用[8]。

1.5 空白基質匹配混合標準溶液的配制

提取3種空白基質水產品樣品，待凈化液減壓旋蒸至干后，加入2.0 mL質量濃度分別為1、5、10、20、40、50、100 μg/L 的混合標準工作溶液復溶，渦旋振蕩，量取1.5 mL溶液振蕩后進行QuEChERS凈化，即可獲得空白基質混合標準溶液，現用現配。

1.6 基質效應（matrix effect，ME）計算

由于質譜分析會普遍存在基質效應，客觀存在的基質效應對方法的精密度、靈敏度以及準確度都會造成影響[3]。本試驗前處理過程會用到大量有機試劑，而且水產品基質復雜，有可能會對目標物產生一定影響。本文參考李婷等[9]的研究方法，通過先萃取后添加的方法，配制質量濃度為0.100 mg/L的4種N-亞硝胺類化合物標準溶劑以及空白基質匹配校準溶劑，在同樣條件下進行分析，根據公式（1）計算ME。

式中：Pm為空白基質匹配校準溶液中N-亞硝胺類化合物的響應值；Ps為標準溶液中N-亞硝胺類化合物的響應值。

當ME=0時，表示溶液中沒有基質效應；當ME＜0時，表示溶液中存在基質抑制；當ME＞0時，表示溶液中存在基質增強效應。試驗所得4種N-亞硝胺類化合物在水產品中都存在基質增強效應。在基質效應均存在的情況下，采用基質匹配標準曲線定量，就可以在一定程度降低基質效應的影響，提高定量結果的準確性。

1.7 色譜條件

色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為220℃，不分流進樣模式。載氣為氦氣，純度為99.99%，流速為1.0 mL/min。升溫程序：30℃，保持3 min，以5℃/min升至100℃，以30℃/min升至240℃，保持5 min；溶劑放空模式進樣：放空溫度為30℃，放空流速：100 mL/min，放空時間為0.42 min，以 600℃/min速率升溫至 300℃，進樣體積：5 μL。

1.8 質譜條件

離子源：EI，離子源的溫度為230℃，四極桿的溫度為150℃，接口的溫度230℃，電子能量為90 eV，碰撞能量均為15 eV。4種揮發性N-亞硝胺類化合物的保留時間、產物離子[10]、前體離子以及其它質譜參數見表1。

表1 4種N-亞硝胺類化合物的保留時間、產物離子以及其他質譜參數Table 1 Retention times，product ions and other MS paramerters of the four N-nitrosamine compounds

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 去脂方式的選擇

對于大多數水產品，QuEChERS的凈化填料具有較好的去除雜質和油脂的作用[11]。但對于油脂含量較高的動物性食品，在凈化濃縮后，會有相對明顯的油脂吸附在玻璃容器管壁上。因此試驗嘗試多種不同的凈化、萃取去脂方式。凝膠色譜凈化方法彌補上述缺陷，在確保精密度和準確度的同時提高了檢測效率。

2.1.2 凈化條件的優化

使用乙腈進行提取，雞心瓶壁內會留有大量復溶不能溶解的油狀殘留物，如果增加溶劑使用量，會導致檢測方法的檢測限降低。同時大量油脂會使得硅膠粉末和N-丙基乙二胺填料不能將樣品凈化干凈，致使色譜基線[12]響應偏高、回收率差、儀器污染等，同時還會存在其它明顯問題。

1）上機樣品量少，如果增加上機樣品量會導致目標物分散，造成收集時間延長，雜質數量增加等多種影響。

2）前處理時間較長，凈化1個樣品基本需要1 h以上。

以上問題在一定程度上限制了凝膠色譜儀的凈化作用，為了更好優化前處理階段去脂效果，參考文獻[13]的方法，在乙腈提取過程中添加正己烷溶液（乙腈飽和）進行去脂。與未經去脂或者QuEChERS凈化的效果進行對比，考察凈化效果。通過回收率考察發現，具有極性的N-亞硝胺類化合物在具有非極性的正己烷中幾乎未被分解，即使用正己烷多次去脂也不會影響乙腈提取液中的N-亞硝胺類化合物含量。因此確定采用正己烷去除乙腈層中的油脂。

2.2 定性、定量方法的選擇

水產品成分復雜，經常會受到基質效應的影響，而且N-亞硝胺類化合物在前處理過程中不穩定，為了更好地對目標物進行定量、定性分析，試驗采用質譜多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）[14]模式進行檢測，使用混合基質標準溶液和內標法進行定量，既排除了基質干擾，又彌補了前處理對整體回收率的影響。

2.3 標準曲線方程、檢出限和定量限

稱取10.00 g試樣，加入100 μL混合內標溶液，配制成質量濃度為 5、10、20、30、50、100、150 μg/L 的 N-亞硝胺類化合物溶液，按照標準方法進行處理，在儀器工作條件下進行測定，得到4種N-亞硝胺類化合物的線性回歸方程，見表2。

表2 4種N-亞硝胺類化合物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation corfficient，limit of detection and limit of quantitation of the 4 N-nitrosamine compounds

由表2可見，4種N-亞硝胺類化合物的線性關系良好，相關系數為0.9985～0.9999。檢出限為0.05 μg/kg～0.10 μg/kg，定量限為 0.1 μg/kg～0.5 μg/kg。本方法靈敏度高，線性范圍廣。

2.4 精密度和回收試驗

將不同質量濃度水平的混合標準溶液添加到空白水產品試樣中，分別制成 1.0、3.0、10.0 μg/kg的加標樣品，按試驗方法每個濃度平行測試6次，得出回收率和測定值的相對標準偏差，結果見表3。

表3 4種N-亞硝胺類化合物的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviation of the 4 kinds of N-nitrosamines compounds（n=6）

結果顯示，經QuEChERS前處理的樣品回收率較未經處理的樣品回收率數值偏高，表明QuEChERS方法在準確性方面具有一定的優勢。

3 結論

本文使用改進的QuEChERS方法，建立了水產品中4種N-亞硝胺類化合物的氣相色譜-質譜聯用儀分析方法，前處理快捷簡單、便于操作，目標化合物損失較低、回收率較高，具有較高的準確性，適用于大批量水產品的檢測，實際檢測運用良好，對日常檢測工作具有一定的指導和借鑒意義。該方法也可以應用于高油脂含量的各類食品中的N-亞硝胺類化合物的測定。