巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病的生防效果及成分鑒定

丁從文，韋羅晴，馬忠璇，周尚澤

（1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點實驗室，廣西 百色 533000；2.百色學院化學與環(huán)境工程學院，廣西 百色 533000）

研究表明，巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，BM）對一些食品病害如香蕉大灰斑病、小麥紋枯病、辣椒疫霉病、花生黃曲霉病及生姜青枯病等均有良好的生防效果[1-5]。也有研究報道BM z12及BM B1301粗提液對水稻紋枯病菌（Corticium sasakii）有抑制效果[6-7]，吉玉玉等[8]報道BM L2粗提物對番茄青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）有抑制作用，趙妗頤等[9]報道BM L2粗提物對魔芋軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）有抗菌活性。然而，關于BM粗提物對由炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides，CG）引起的芒果炭疽病的防治測試及BM粗提物中活性成分的分離鑒定，文獻中少見報道。

前期研究已表明，BM LB01發(fā)酵濾液抑制了采后芒果CG菌絲生長和孢子萌發(fā)，抑制了芒果炭疽病的病斑擴展及芽管伸長[10]。本文在前期研究基礎上，采用乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）、石油醚（petroleun ether，PE）和二氯甲烷（dichloromethane，DCM）等有機溶劑對BM LB01發(fā)酵濾液中活性成分進行萃取，研究其粗提物對采后貯藏期芒果炭疽病菌的抑菌效果，并對防病效果最佳的粗提物進行活性成分分離純化和結構鑒定，本期研究將為防治采后芒果炭疽病的新藥合成提供微生物源先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株BM LB01：分離于百色市靖西縣巖溶區(qū)芒果園果樹根基土壤，保存于百色學院化學與環(huán)境工程學院天然有機化學研究室芽孢桿菌菌株儲藏柜；病原菌CG：百色學院農(nóng)業(yè)與食品工程學院提供；七成熟“臺農(nóng)”1號芒果：百色市靖西縣巖溶區(qū)芒果園；EA、PE、二甲基亞砜、DCM、施保克（分析純）：西亞化學科技（山東）有限公司；柱層析硅膠粉（100目～200目）、薄層層析硅膠板（F254）：煙臺維啟化工產(chǎn)品有限公司；大孔吸附樹脂（D101）：天津市津達正源有限公司。

1.2 儀器與設備

MFa-b微孔膜過濾器：杭州惠合機械設備有限公司；XPR微量電子天平：梅特勒-托利多國際有限公司；GGC-X小型試管翻轉振蕩萃取器：北京國環(huán)高科自動化技術研究院；SE-1000小型旋轉蒸發(fā)儀：北京儀信網(wǎng)通科技有限公司；LGZE-250型生化培養(yǎng)箱：杭州勒豐科技有限公司；EasYDish圓形細胞培養(yǎng)皿：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；M2200-12道移液槍：杭州中旺科技有限公司；EFT-60/90臺式核磁共振波譜儀：QUANTUM量子科學儀器貿(mào)易（北京）有限公司；HT-JZ-1接種器：濟南騰昊科學儀器有限公司；DSX-280KB24高壓滅菌器、ZX-1800超凈工作臺：凱越機械有限公司；RMP-SAC生物層析柱：江陰市新輝層析設備有限公司；Nexera MP制備型高效液相色譜儀：廣州領托貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的制備

參考文獻[10]的方法制備900 mL BM LB01無菌發(fā)酵濾液，于此發(fā)酵濾液中加入900 mL EA和200 mL H2O，劇烈搖動1 h，浸泡24 h，靜置分層后取上層EA相。下層水相再次用等體積的EA浸泡相同時間，共萃取3次。將3次得到的EA相合并，用無水Na2SO4干燥后于旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮，收集EA相浸膏。

采用同樣的操作方法，制備PE和DCM相浸膏。

1.3.2 巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病的防治效果測定

1.3.2.1 藥液配制

采用電子天平準確稱量EA相浸膏1、2、4 mg溶解于熔融（45℃）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基或者二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，配制 20、40、80 μg/mL 3 個系列濃度（藥量500 mL），貼上標簽，用于測定三類溶劑粗提物的體外和體內(nèi)抗菌活性。稱取4 mg施保克溶于DMSO中配制80 μg/mL藥液，供試體積用量為500 mL。

采用同樣的配制方法，配制PE和DCM相浸膏20、40、80 μg/mL 3 個系列濃度（藥量 500 mL）。

1.3.2.2 培養(yǎng)基的配制及病原菌CG分生孢子懸浮液的制備

參照文獻[11-13]的方法，進行PDA、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制及病原菌CG分生孢子懸浮液的制備，病原菌CG分生孢子懸浮液培養(yǎng)時間為4 d，并將其濃度調(diào)節(jié)為1.0×106/mL。

1.3.2.3 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的體外抗菌活性測定

將EA、PE和DCM萃取相浸膏添加到熔融的PDA（45℃）培養(yǎng)基中，得到最終質量濃度分別為0、20、40、80 μg/mL的萃取相浸膏。在PDA板中心接種直徑為6 mm的菌餅，黑暗中28℃恒溫培養(yǎng)。直至對照組病原菌CG菌絲貼近培養(yǎng)皿邊緣時，用游標卡尺計量菌落生長直徑。每個菌落用十字交叉法垂直測量各一次，取其平均值。根據(jù)計量的菌絲生長直徑，計算BM LB01粗提物對病原菌CG菌絲生長抑制率，并比較不同溶劑粗提物對CG菌絲生長的抑制活性，依據(jù)文獻[14]的方法，統(tǒng)計BM LB01粗提物在1 d～6 d內(nèi)對病原菌CG的菌絲生長抑制率。抑制率按如下公式計算。

1.3.2.4 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的體內(nèi)抗菌活性測定

以七成熟的“臺農(nóng)”1號芒果為試驗材料，用無菌水對芒果進行沖洗，用NaClO消毒，在空氣中風干后于芒果果實中心位置打孔（孔寬4.5 mm，孔深1.5 mm），用于接種病原菌CG和各類藥劑，進行體內(nèi)抗菌活性試驗。

試驗共分為6個小組，10次重復。

（1）陰性對照組（編號為T1）：未給藥，也未接種病原菌 CG；（2）陽性對照組（編號為 T2）：僅接種 CG；（3）處理組（編號為 T3）：200 μL 80 μg/mL 施保克+CG；（4）處理組（編號為T4）：200 μL BM LB01發(fā)酵濾液+CG；（5）處理組（編號為 T5）：200 μL 80 μg/mL EA 粗提物藥液+CG；（6）處理組（編號為 T6）：200 μL 80 μg/mLPE粗提物藥液+CG。

除T1外的所有處理中，芒果果實傷口接種的病原菌CG分生孢子懸浮液的體積和濃度均為100 μL、1.0×106/mL，T3～T6組接種各類藥液1.5 h后，再接種病原菌CG。參考文獻[15]的計算方法，于第7天統(tǒng)計供試組芒果病斑面積（lesion area，LA）及藥劑生防效果（biocontrol efficacy，BE）。

1.3.3 巨大芽孢桿菌LB01粗提物化學成分的分離純化

將EA相浸膏（5 g）和D101大孔樹脂（5 g）混合于燒瓶中，再注入250 mL PE，室溫（20℃～25℃）下電磁攪拌5 min，用砂芯漏斗抽濾，用干法將樣品裝上大孔樹脂柱初步分離，不同體積比（5∶1、1∶1、1∶5）洗脫劑PEEA對樣品進行減壓梯度洗脫[16]，共收集到F1～F4 4個組分，組分F3（90 mg）用100目～200目硅膠柱分離，洗脫劑 DCM-PE（體積比為 1∶5、1∶1、5∶1）進行梯度洗脫，共收集到F5～F8 4個組分。用薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）檢測，用反相制備型高效液相色譜法進行精細分離純化[17]。將 F2（75 mg）和 F8（95 mg）組分用反相制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化，洗脫劑 CH3CN-H2O（體積比 1∶4）洗脫，最終獲得單一活性成分 a（28 mg）、b（30 mg）、c（32 mg）。

1.3.4 巨大芽孢桿菌LB01粗提物化學成分的結構鑒定

將單一活性成分a、b、c溶于DMSO-d6（碳譜測定無需氘代溶劑），形成溶液后加入核磁管進行氫譜（1hydrogen nuclear magnetic resonance，1H-NMR）和碳譜（13carbon nuclear magnetic resonance，13C-NMR）測定，獲取的數(shù)據(jù)與原始文獻比對鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010對數(shù)據(jù)作圖，通過SPSS軟件，進行結果差異性分析，p＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病菌生長的體外抑制

采用乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）和二氯甲烷（DCM）為萃取劑，從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）LB01 發(fā)酵濾液中萃取的 0（對照）、20、40、80 μg/mL等不同濃度的粗提物對PDA平板上炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）生長的抑制作用情況，如圖1所示。

圖1 不同濃度粗提物對PDA板上炭疽病菌的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of crude extracts with different concentrations against Colletotrichum gloeosporioides on PDA board

由圖1可知，EA、PE和DCM粗提物對PDA平板上接種的炭疽病菌的抑制活性順序為EA相浸膏＞PE相浸膏＞DCM相浸膏。

表1～表3為不同濃度的EA、PE和DCM粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率。

表1 不同濃度的EA粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率Table 1 Inhibition rate of different concentrations of crude extracts by EA on mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides

表2 不同濃度的PE粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率Table 2 Inhibition rate of different concentrations of crude extracts by PE on mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides

表3 不同濃度的DCM粗提物對炭疽病菌菌絲生長的抑制率Table 3 Inhibition rate of different concentrations of crude extracts by DCM on mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides

表1～表3顯示，EA和PE粗提物抑制病原菌生長的效果優(yōu)于DCM。EA和PE粗提物（80 μg/mL）在培養(yǎng)2 d后對病原菌生長的抑制率最高，分別為（76.2±5.2）%和（75.3±6.5）%。第2天后，不同溶劑粗提物對病原菌的生長抑制效果隨處理時間的延長而降低。而不同溶劑粗提物的抗菌活性隨粗提物濃度的增加而增加，反之亦然。由于DCM粗提物的抗菌活性較低，因此選擇EA和PE粗提物進行芒果果實體內(nèi)防治試驗測定。

2.2 巨大芽孢桿菌LB01粗提物對采后芒果炭疽病的體內(nèi)防治效果

為研究巨大芽孢桿菌LB01 EA和PE粗提物對采后芒果炭疽病的體內(nèi)防治效果，本試驗于第7天觀察了供試組（T1～T6）芒果的發(fā)病情況，測定了它們的病斑面積，并統(tǒng)計了各類藥劑的生防效果。其試驗結果如圖2及表4所示。

圖2 芒果貯藏至第7天后的炭疽病發(fā)病情況Fig.2 Symptoms of postharvest mango anthracnose after 7 days storage

表4 不同藥劑處理對采后芒果炭疽病病斑面積及生防效果統(tǒng)計結果Table 4 Statistical results of lesion area and biocontrol efficacy of postharvest mango anthracnose treated with different fungicides

由圖2可以得出，陽性對照組（T2）接種芒果炭疽病菌7 d后出現(xiàn)明顯的炭疽病病害癥狀，傷口擴大并覆蓋了整個損傷口區(qū)域。施保克處理組（T3）和EA粗提物處理組（T5）的芒果發(fā)病程度相似，并且比較輕微。T3和T5對芒果采后炭疽病的防治效果明顯優(yōu)于巨大芽孢桿菌LB01發(fā)酵濾液（T4）及PE粗提物處理組（T6）。陰性對照組（T1）沒有接種芒果炭疽病菌，也沒有給藥，但貯藏至第7天后，T1與T5～T6類似，也出現(xiàn)病斑，可能是潛伏于采前芒果中的炭疽病菌所致。

由表4統(tǒng)計結果可知，采用化學殺菌劑施保克（T3）和EA粗提物（T5）施藥1.5 h后，于芒果果實損傷口上接種炭疽病菌孢子懸浮液（1.0×106/mL），培養(yǎng)7 d后芒果炭疽病受到強烈抑制。T3和T5組的芒果病害表現(xiàn)狀態(tài)與T1（陰性對照）相似。巨大芽孢桿菌LB01發(fā)酵濾液和PE粗提物對芒果炭疽病的防治效果均低于EA粗提物。EA粗提物（T5）的病斑面積（LA）與陽性對照組（T2）相比較，顯著降低（p＜0.05），并且 EA 粗提物（T5）對芒果炭疽病的防治效果高達（89.55±1.12）%，比T4和T6高10%以上。

2.3 巨大芽孢桿菌LB01粗提物的化學成分結構鑒定

將體外和體內(nèi)防病效果均最佳的EA粗提物浸膏通過大孔樹脂、硅膠和反相制備型液相色譜分離純化后獲得3個單體化合物a、b、c，其熔點、氫譜和碳譜數(shù)據(jù)如下。

化合物a：無色針狀晶體，熔點201℃～203℃；1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ:3.29（2H，s，H-2），6.71（2H，d，J=7.6 Hz，H-5，7），7.15（2 H，d，J=7.6 Hz，H-4，8）；13CNMR（150 MHz，CH3CN）δ:39.8（C-2），119.1（C-5，7），126.0（C-3），132.1（C-4，8），160.3（C-6），181.3（C-1）。以上熔點及核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻[18-19]報道的4-羥基苯乙酸的數(shù)據(jù)相符。

化合物b：無色針狀晶體，熔點187℃～189℃；1HNMR （600 MHz，DMSO-d6）δ:5.64 （2H，s，-NH2），6.83（2H，d，J=10.0 Hz，H-3，7），7.78 （2H，d，J=10.0 Hz，H-4，6）；13C-NMR（150 MHz，CH3CN）δ:114.9（C-2），117.2（C-3，7），134.2（C-4，6），156.1（C-5），179.5（C-1）。以上熔點及核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻[20-21]報道的4-氨基苯甲酸的數(shù)據(jù)相符。

化合物c：淺黃色晶體，熔點174℃～176℃；1HNMR（600 MHz，DMSO-d6）δ:3.92（3H，s，H-10），6.62（1H，d，J=16.1 Hz，H-9），6.96（1H，d，J=9.2 Hz，H-5），7.07（1H，dd，J=9.2，2.4 Hz，H-3），7.31（1H，d，J=2.4 Hz，H-2），7.82（1H，d，J=16.1Hz，H-8）。13C-NMR（150 MHz，CH3CN）δ:53.7（C-10），111.2（C-3），116.4（C-5），116.9（C-8），123.3（C-6），126.1（C-9），145.3（C-4），149.1（C-7），150.2（C-2），178.0（C-1）。以上熔點及核磁圖譜數(shù)據(jù)與文獻[22-23]報道的3-甲氧基-4-羥基肉桂酸的數(shù)據(jù)相符。

基于以上數(shù)據(jù)可以推斷粗提物中化學成分a、b、c的結構式如圖3所示。

圖3 EA粗提物中化學成分的結構式Fig.3 Structural formula of compounds from crude extract of EA

3 結論

本試驗先用乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）和二氯甲烷（DCM）3種不同極性有機溶劑作為萃取劑制備了3類巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，BM）LB01粗提物。PDA平板離體試驗法確認了0（對照）、20、40、80 μg/mL EA和PE粗提物抗菌活性明顯強于DCM粗提物，芒果活體試驗中，80 μg/mL EA粗提物對采后芒果炭疽病的活體防治效果類似于化學殺菌劑施保克，且顯著優(yōu)于PE粗提物。最后采用大孔樹脂、硅膠柱及制備型液相色譜等方法對防病效果最佳的EA粗提物化學成分進行分離純化，通過氫譜和碳譜數(shù)據(jù)測定，并與原始數(shù)據(jù)比照進行化學成分鑒定，共獲得3個化合物 a（4-羥基苯乙酸）、b（4-氨基苯甲酸）、c（3-甲氧基-4-羥基肉桂酸）。